• cellule epiteliali di cristallino bovino (BLE)
• cistationina β-sintasi (CBS)
• cistationina γ-liasi (CGL)
• cystathionine β-synthase
• cystathionine γ-lyase
• epithelial cells of bovine crystalline lens.
• glutathione
• glutatione (GSH)
• transsulfuration pathway
• via di transulfurazione

RIASSUNTO

Nei mammiferi la cisteina può essere assunta con la dieta o può essere sintetizzata a partire da metionina e serina nella via di transulfurazione. La metionina e la cisteina sono metabolicamente collegate attraverso il percorso unidirezionale della via di transulfurazione che utilizza la metionina come risorsa di zolfo per la sintesi della cisteina. La metionina è il precursore dell’omocisteina, amminoacido che collega la via di transmetilazione a quella di transulfurazione.
In presenza di adenosina trifosfato (ATP) l’enzima metionina adenosiltrasferasi trasforma la metionina in S-adenosilmetionina, a sua volta successivamente idrolizzata in adenosina e omocisteina per azione di una adenosilomocisteinasi. A questo punto l’omocisteina può essere indirizzata nella via di transulfurazione o nella via di rimetilazione per risintetizzare la metionina. Nella via di transulfurazione l’omocisteina porta alla produzione di cisteina attraverso le reazioni catalizzate da due enzimi piridossal-5’-fosfato dipendenti (PLP), la cistationina β-sintasi (CBS) e la cistationina γ-liasi (CGL). La CBS catalizza la condensazione di omocisteina e serina per formare la cistationina con una reazione irreversibile; la cistationina è quindi idrolizzata attraverso la CGL a dare cisteina, α -chetobutirrato e ammoniaca. La cisteina qui prodotta può essere utilizzata per la sintesi di glutatione (GSH).
Il GSH rappresenta il primo mezzo di difesa contro lo stress ossidativo e per la sua sintesi la cisteina risulta essere l'amminoacido limitante. Per queste ragione recenti studi si sono rivolti ad un possibile effetto dello stress ossidativo sul flusso della via di transulfurazione, e di conseguenza sulla sintesi di cisteina.
Recenti esperimenti evidenziano infatti un incremento del flusso della via di transulfurazione ed in particolare dell'attività enzimatica e dell'espressione dell’enzima CBS, in cellule epiteliali di cristallino umane (HLE) sottoposte a stress ossidativo per incubazione in presenza di perossido di idrogeno.
Obbiettivo del presente lavoro di tesi è stata quindi la valutazione della presenza degli enzimi della via di transulfurazione, ed in particolare della CGL in cellule epiteliali di cristallino bovino, valutando la possibilità che condizioni di stress ossidativo, in conseguenza ad incubazioni con perossido di idrogeno, possano indurre dei cambiamenti sui livelli di glutatione intracellulare e sull'attività dell'enzima CGL.
Una parte rilevante del presente lavoro di tesi è stata anche la messa a punto, in questa linea cellulare, di una metodica per il dosaggio del contenuto di GSH e di GSSG intracellulare recentemente sottoposta a brevetto (Cappiello et al. 2011) nel laboratorio dove ho svolto il lavoro di tesi.

ABSTRACT
In mammals, cysteine can be taken with food or may be synthesized from methionine and serine in the transsulfuration pathway which uses methionine as a source of sulfur for the synthesis of cysteine.
In the presence of adenosine triphosphate (ATP) the enzyme methionine adenosyltransferase converts methionine in S-adenosylmethionine, which is hydrolyzed to adenosine and homocysteine by adenosylhomocysteinase. At this point the homocysteine can be addressed to the transsulfuration pathway for the synthesis of cysteine or to the remethylation pathway in order to resynthesize methionine. Metabolic interconversion of cysteine and homocysteine in the transsulfuration pathway, with cystathionine as intermediate product, involve two reactions catalysed by two enzymes pyridoxal-5'-phosphate dependent (PLP), cystathionine β-synthase (CBS) and cystathionine γ-lyase (CGL). CBS catalyzes the condensation of homocysteine and serine to produce cystathionine in a irreversible reaction; cystathionine is then hydrolyzed by CGL to give cysteine, alpha-ketobutyrate and ammonia. Cysteine here produced can be used for glutathione synthesis (GSH).
GSH is one of the main defense against oxidative stress and cellular cysteine level appears to be relevant for its synthesis. For these reason, recently many studies have considered a possible effect of oxidative stress on the flow of the transsulfuration pathway, and consequently on the synthesis of cysteine.
Recent experiments show in fact an increase of the flow of transsulfuration pathway and in particular of the enzymatic activity and expression of the enzyme CBS in epithelial cells of human crystalline lens (HLE), which is subject to oxidative stress by incubation in the presence of hydrogen peroxide.
Objective of the present thesis work was therefore the evaluation of the presence of transsulfuration enzymes and in particular of CGL in epithelial cells of bovine crystalline lens, considering the possibility that conditions of oxidative stress, as a consequence of incubations with hydrogen peroxide, could induce changes on intracellular glutathione levels and on activity of cystathionine γ-lyase.
A significant part of this thesis work was also the finding of application conditions, in this cell line, of a method for the determination of GSH and GSSG intracellular contents, which was recently patented (Cappiello et al. 2011) in the laboratory where the thesis work was carried out.