• carcinoma mammario e/o ovarico
• splicing alternativo
• trascritti aberranti brca1/brca2

Il ruolo dello splicing alternativo quale meccanismo di inattivazione dei geni brca1 e 2 nel tumore familiare della mammella e/o ovaio

L’identificazione dei geni BRCA1 e BRCA2 e delle loro alterazioni è stata fondamentale per la comprensione delle forme familiari dei carcinomi al seno e all’ovaio.
Lo screening mutazionale basato su PCR e sequenziamento diretto, ha permesso l’identificazione di più di circa 1560 differenti alterazioni germinali nel gene BRCA1 e 1880 in BRCA2, la maggior parte delle quali consistono in mutazioni puntiformi e piccole delezioni o inserzioni. Tali alterazioni riscontrate sia nella sequenza codificante che in corrispondenza delle giunzioni introni-esoni, introducono nell’80% dei casi codoni di stop prematuri. Inoltre, in alcune famiglie sono stati identificati grandi riarrangiamenti genomici. Tuttavia, nella maggiorparte delle donne con storia familiare di tumore alla mammella e/o ovaio, non è stato possibile identificare mutazioni dei due geni. Approssimativamente uno su otto varianti identificate in BRCA1 e BRCA2 è di significato patogenetico sconosciuto, e quindi la sua scoperta non ha un riscontro clinico immediato. Fra queste varianti possiamo annoverare quelle determinanti splicing alternativi dell’mRNA. La natura altamente variabile di questo meccanismo può presentare alterazioni a vari livelli; tra queste, le varianti identificate nelle regioni introniche dei due geni che potrebbero distruggere la capacità di splicing ma che non sono predicibili dalla sola analisi della sequenza genomica.
Scopo di questa tesi è quindi quello di mettere in evidenza eventuali trascritti alternativi derivanti da aberranti splicing usando un approccio di RT-PCR standard su RNA estratto da linfociti di donne con accertata storia familiare di tumore alla mammella e/o ovaio, in cui non sono state evidenziate mutazioni patogenetiche tipo frameshift o nonsenso, ma che all’analisi a priori calcolata con i software BRCAPRO e BOADICEA presentavano un alto rischio di mutazione.
Il messaggero di BRCA1 è lungo 5592 mentre quello di BRCA2 è 10987; al fine di poter testare tutti i possibili trascritti, compresi quelli fisiologici e considerando l’estrema lunghezza di questi, sono stati disegnati coppie di oligonucleotidi in grado di amplificare regioni sovrapposte del messaggero ma che in totale coprono l’intero mRNA.
I linfociti sono stati ottenuti da sangue periferico di pazienti con carcinoma alla mammella e/o ovaio afferiti presso il Centro Interdipartimentale di Genetica-Oncologica Ospedale Universitario Santa Chiara Pisa.
L’identificazione e la caratterizzazione di eventuali trascritti aberranti mediante analisi dell’mRNA può permettere il riconoscimento di famiglie con mutazioni inattivanti i geni BRCA1/2 le quali potranno fare aumentare la frequenza di mutazione rispetto alla semplice analisi genomica.
A tal proposito sono stati analizzati i trascritti dei geni BRCA1 e BRCA2 di 13 pazienti. In questa tesi sono stati identificati 6 trascritti alternativi per BRCA1 e 6 per BRCA2. Dei 6 trascritti di BRCA1, 4 erano già conosciuti essere varianti fisiologiche, mentre 2 sono forme probabilmente patogenetiche perché producono trascritti con exon skipping che danno una proteina tronca. Quest’ultimi due riguardano rispettivamente un trascritto che manca dell’esone 17 e uno mancante dell’esone 15. Il trascritto con la delezione dell’esone 17, è stato già descritto in letteratura come prodotto da una delezione genomica, causata da ricombinazione omologa alterata, dovuta alla presenza di un alta percentuale di alu repeats, nell’introne 16 e 17. Nel nostro caso, comunque, non abbiamo evidenziato, con la tecnica dell’MLPA alcuna alterazione genomica. Per quanto riguarda l’altro paziente, dall’analisi della sequenza del trascritto, amplificato dall’esone 13 all’esone 16,è stato visto lo skipping dell’esone 15 che altera il modulo di lettura, e determina proteina tronca, ed è da tenere in considerazione come correlabile alla suscettibilità tumorale della paziente. In ultima analisi, quindi, risulta che l’indagine dei trascritti alternativi dei geni BRCA1 e BRCA2 ha messo in evidenza la presenza del 15% di varianti probabilmente patogenetiche che non erano state rivelate da altre metodiche di screening mutazionale. Le nuove tecnologie di sequenziamento “massivo parallelo” applicate all’analisi dei trascritti potrebbero essere di grande interesse nella ricerca clinica consentendo l’identificazione di trascritti patologici non predicibili dall’analisi del DNA genomico. In particolare potrebbero sostanzialmente modificare la definizione del quadro mutazionale associato ai geni BRCA1 e BRCA2 nel tumore alla mammella e/o ovaio ereditari.

Abstract
The role of the alternative splicing as inactivation mechanism of brca1 and brca2 genes in breast and/or ovarian cancer family

The identification of BRCA1 and BRCA2 genes and their alterations has been essential for the understanding of the familial forms of breast and ovarian carcinomas. Mutational screening based on PCR and direct sequencing, has allowed the identification of more than 1560 different germline alterations in the BRCA1 gene and 1880 in the BRCA2 gene, most of which consist of point mutations and small deletions or insertions. Such alterations found both in the coding sequence and in the intron-exon junction, introduce, in the 80% of cases, premature stop codons. In addition, in some families, large genomic rearrangements have been identified. However, in most of women with a familial history of breast and / or ovarian cancer has not been possible to identify mutations in both genes. Approximately one out of eight variants identified in BRCA1 and BRCA2 has an unknown pathogenic significance, and its discovery has no immediate clinical response. Among these variants we can include those determining alternative mRNA splicing. The highly variable nature of mRNA splicing mechanism could results in alterations at various levels. Among these alterations, we may include the variants identified in the intronic regions that could destroy the ability to splicing but that are not predictable by direct sequencing of exons and boundering genomic sequence.
The purpose of this thesis is to highlight any aberrant transcripts resulting from alternative splicing using two approaches: RT-PCR on RNA extracted from lymphocytes of women with known familial history of breast and/or ovarian cancer, in which have not been highlighted pathogenic alterations, as frameshift or nonsense mutations, but in which the a priori risk of mutation calculated by the two software BRCAPRO and BOADICEA is >10%. The mRNA of BRCA1 is 5592bp long and the BRCA2 mRNA is 10987bp long; to test all the possible transcripts, including the physiological ones and considering the extreme length of these, we designed pairs of oligonucleotides able to amplify the overlapping regions of the mRNA and to cover , in this way, the entire mRNA. Lymphocytes were obtained from peripheral blood of patients with breast and /or ovarian cancer recruited at the Interdepartmental Centre for Cancer Genetics -University Hospital of Santa Chiara in Pisa.
The identification and characterization of any aberrant transcripts by mRNA analysis may allow the recognition of families with inactivating mutations of otherwise misclassified as BRCA1 and BRCA2 wilde type . For this purpose, we analyzed the transcripts of BRCA1 and BRCA2 genes in 13 patients and we identified 6 alternative transcripts for BRCA1 and 6 for BRCA2. Among the 6 BRCA1 transcripts, 4 were already known to be physiological variants, while 2 are probably pathogenic forms that produce transcripts with exon skipping giving a truncated protein. The last two transcripts are lacking , respectively, of the exon 17 and of the exon 15. The transcript with the deletion of exon17, was already described in the literature as produced by a genomic deletion, caused by an altered homologous recombination due to the presence of an high percentage of alu-repeats in the introns 16 and 17. However, in our case, we do not have highlighted any genomic alterations by the MLPA technique. Regarding the second patient, by a direct sequencing of the transcript, amplified from the exon 13 to the exon 16, it was seen the skipping of the exon 15 that alters the open reading frame determining the production of a truncated protein that could be considered as correlated with the tumor susceptibility of the patient.
In conclusion, this investigation of alternative transcripts of BRCA1 and BRCA2 genes , has revealed the presence of 15% of probably pathogenic variants that were not revealed by other methods of mutation screening. The new " high throughput " sequencing technologies applied in the transcripts analysis could be of great interest in clinical research leading to the identification of pathological transcripts not predictable from the analysis of genomic DNA. In particular they could substantially change the definition of the mutational frame associated with BRCA1 and BRCA2 genes in hereditary breast and / or ovarian cancer.