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Tesi etd-02162017-153628


Thesis type
Tesi di laurea magistrale LM5
Author
CARMIGNANI, GIULIA
URN
etd-02162017-153628
Title
Attivita' di MET inibitori verso i recettori Smoothened: nuovo target nel trattamento del carcinoma polmonare
Struttura
FARMACIA
Corso di studi
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Commissione
relatore Prof.ssa Trincavelli, Maria Letizia
relatore Dott.ssa Giacomelli, Chiara
Parole chiave
  • Recettore SMO
  • Recettore MET
  • Recettore EGFR
  • Meccanismi resistenza EGFR
  • NSCLC
  • EGFR TKIs
  • Binding recettoriale
Data inizio appello
08/03/2017;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
08/03/2020
Riassunto analitico
Con 1.6 milioni di decessi in tutto il mondo registrati nel 2012, il tumore del polmone rappresenta la prima causa di morte per cancro in entrambi i sessi, con un tasso di sopravvivenza inferiore al 50% entro i 12 mesi dalla diagnosi e meno del 18% nei 5 anni successivi. Causato principalmente dal fumo di sigaretta, è associato anche a fattori genetici e ambientali, quali l&#39;esposizione al radon, all&#39;amianto e a vari agenti chimici, oltre che all&#39;inquinamento atmosferico. Il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) è la tipologia più comune di tumore al polmone, rappresentandone l&#39;85% dei casi. Di origine epiteliale, dal punto di vista istologico viene distinto in tre principali sottotipi: il carcinoma a cellule squamose, l&#39;adenocarcinoma e il carcinoma a grandi cellule. L’NSCLC è un tumore particolarmente invasivo e pressoché asintomatico, se non negli stadi avanzati. Negli stadi iniziali della neoplasia, quando possibile, si interviene con la rimozione chirurgica, parziale o totale, della parte di organo colpita. Al contrario, in caso di NSCLC metastatico, o qualora la rimozione chirurgica si riveli impossibile da intraprendere, si ricorre in prima linea alla chemioterapia e radioterapia. <br>Tuttavia, la maggior parte dei pazienti progredisce dopo il trattamento con la chemioterapia e pertanto viene sottoposta a trattamenti di II e III linea. I principali farmaci utilizzati sono degli inibitori delle proteine tirosin-chinasiche (TKI), in particolare sono utilizzati derivati chinazolinici, quali gefitinib ed erlotinib, che inibiscono l’attività del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), solitamente espresso sulla membrana delle cellule del carcinoma polmonare. Gli EGFR-TKIs hanno riscontrato una buona efficacia nei pazienti affetti da NSCLC, soprattutto su una sottopopolazione recante una mutazione dell’EGFR che lo attiva. Tuttavia, dopo un&#39;iniziale risposta agli EGFR-TKIs, si osservano fenomeni di resistenza che determinano il fallimento della terapia. Pertanto, sono stati presi in considerazione nuovi target molecolari, la cui sovra-espressione risulta essere coinvolta nella carcinogenesi dell&#39;NSCLC e nei meccanismi di resistenza dell&#39;EGFR mutato. Tra questi, il recettore per il fattore di crescita epatocitario (MET) ha destato notevole interesse, portando allo sviluppo di composti che vanno a inibire la sua attività, come foretinib e tivantinib, attualmente in corso di sperimentazione clinica avanzata. Tuttavia, sembra che una loro inibizione da sola non sia sufficiente a contrastare il carcinoma polmonare. Come compensazione all’inibizione dell’EGFR, è stata inoltre dimostrata una sovra-espressione del recettore Smoothened (SMO). Inibitori di SMO, come il vismodegib, sono entrati in trial clinici per il trattamento dell&#39;NSCLC. Recentemente, la sinergica azione anti-proliferativa, dovuta alla contemporanea inibizione di MET e SMO, è stata osservata in cellule NSCLC con EGFR mutato e resistenti agli EGFR-TKIs. Questo ha posto le basi per lo sviluppo di potenziali agenti farmacologici dotati di attività dual-target verso MET e SMO. Con questo scopo, uno studio condotto dai ricercatori dell&#39;Università degli Studi di Napoli Federico II si è proposto di selezionare, attraverso tecniche di Virtual Screening basate sul docking molecolare, una serie di inibitori del recettore MET, già noti in letteratura, come potenziali ligandi del recettore SMO. Tale approccio è stato giustificato da una simile modalità di interazione dei suddetti inibitori con il rispettivo recettore.<br>Lo scopo del presente lavoro di tesi è stato quello di caratterizzare l’attività biologica di MET inibitori come potenziali inibitori di SMO. Per verificare l’interazione diretta sul recettore SMO dei ligandi, selezionati tramite il modello teorico-computazionale, è stato allestito e messo a punto un dosaggio radioattivo, con l&#39;impiego di [3H]-ciclopamina. <br>La linea cellulare di carcinoma polmonare HCC827-GR è stato dimostrato sovra-esprimere il recettore SMO. Tuttavia, dall’analisi genica del recettore è emersa la presenza di una mutazione a livello della valina 404 (V404M). In primo luogo, è stato caratterizzato il recettore SMO in tale linea in termini di espressione e affinità. I risultati ottenuti hanno dimostrato che SMO è espresso nelle cellule HCC827-GR (Bmax = 1.45 pmol/mg) con una affinità (Kd = 38.7) paragonabile a quella ottenuta in cellule che esprimono il recettore wild-type (Kd = 20). Pertanto, la mutazione del recettore non appare indurre alcuna significativa variazione di affinità della ciclopamina per il recettore SMO.<br>In seguito, è stato allestito un saggio di binding in competizione per valutare l&#39;affinità dei composti selezionati per il recettore SMO, recante la mutazione V404M. Alcuni dei composti selezionati non sono stati in grado di spiazzare il radioligando, mostrando un&#39;affinità bassa per il recettore SMO, altri composti invece sono risultati capaci di competere con il radioligando, mostrando un’affinità nell’ordine del nanomolare. Infine, per confermare che la mutazione non interferisca con l’interazione ligando-SMO, è stata valutata l’affinità dei ligandi più promettenti anche sul recettore SMO wild-type. A tal fine sono state utilizzate preparazioni di membrane ottenute da cellule HEK293T, che sovra-esprimono SMO, disponibili commercialmente. I risultati ottenuti sul recettore wild-type si sono rivelati paragonabili a quelli ottenuti sulle cellule HCC827-GR recanti il recettore mutato. <br>I risultati ottenuti dai saggi funzionali in vitro hanno quindi confermato i dati di modelling molecolare, dimostrando che i derivati selezionati sono in grado di agire come modulatori diretti della proteina SMO e possono essere considerati ottimi lead per lo sviluppo di inibitori dual-target, capaci di contrastare quella parte di carcinomi polmonari resistenti alle terapie classiche.<br>
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