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Tesi etd-02152012-143501


Thesis type
Tesi di laurea magistrale
Author
COZZANI, CRISTINA
URN
etd-02152012-143501
Title
Influenza dei "pathways" di riparazione del DNA sulla instabilita genomica indotta dall'espressione di BRCA1 nel lievito Saccharomyces cerevisiae
Struttura
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI E INDUSTRIALI
Commissione
relatore Dott.ssa Spugnesi, Laura
relatore Prof. Galli, Alvaro
Parole chiave
  • instabilità genomica
  • reversione
  • ricombinazione intracromosomica
  • Saccharomys cerevisiae
  • pathways riparazione
  • brca1
Data inizio appello
07/03/2012;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
07/03/2052
Riassunto analitico
I carcinomi della mammella e dell’ovaio rappresentano le prime cause di mortalità per tumore nella donna. Uno dei geni che, se mutato, conferisce il più elevato rischio di sviluppare questa sindrome tumorale ereditaria è BRCA1. <br>Nei mammiferi BRCA1 è situato sul cromosoma 17, è composto da 24 esoni e codifica per una proteina in grado di interagire con varie proteine come ad esempio BARD1 e con p53, o formare un macrocomplesso proteico, definito BASC, coinvolto nella riparazione del DNA e nella progressione del ciclo cellulare. Il gene BRCA1 è polimorfico, ovvero può presentare diverse mutazioni a singola base lungo la sua sequenza, alcune sono note e associate ad un aumento di instabilità genomica, alcune classificate come neutre e quindi non associate allo sviluppo del tumore, e altre non ancora del tutto conosciute.<br>L’impiego di S. cerevisiae come sistema di espressione di una proteina umana può risultare un ottimo metodo di analisi in quanto, nonostante nel lievito non sia presente l’omologo di BRCA1, tale organismo conserva gli stessi “pathway” di riparazione del DNA presenti nell’uomo, e inoltre riesce a sintetizzare la proteina BRCA1.<br>Lavori precedentemente pubblicati dal gruppo di ricerca dove ho svolto la tesi, dimostrano che l&#39;espressione di BRCA1 wild-type e di due varianti missenso neutre non induce aumento di ricombinazione nel ceppo diploide di Saccharomyces cerevisiae RS112, al contrario l’espressione di varianti cancro-correlate determina un significativo aumento della ricombinazione. Poiché, è noto che negli eucarioti superiori BRCA1 è coinvolto nella riparazione del DNA, l’ipotesi è che l’espressione di BRCA1 in ceppi di lievito riparazione-deficienti possa influenzare l’instabilità genomica misurabile come effetto sulla ricombinazione e sulla reversione, e quindi possa dare un contributo per capire se un pathway specifico possa essere coinvolto nella determinazione del tumore. <br>Abbiamo espresso BRCA1 e diverse varianti missenso in due ceppi aploidi di lievito: RSY6msh2Δ che è difettivo per il processo di riparazione dei disaccoppiamenti di base del DNA (“mismatch repair”); e RSY6rad52Δ che ha un difetto nella riparazione per ricombinazione omologa. <br>I vettori di espressione per BRCA1wt e per le varianti missenso sono stati trasformati nei due ceppi difettivi e per comparazione nel ceppo RSY6RAD52MSH2. <br>Dopo aver selezionato i ceppi trasformati e aver dimostrato per Western blot che BRCA1 viene espressa anche nei ceppi difettivi, abbiamo determinato il suo effetto sulla ricombinazione e reversione. <br>Dai risultati ottenuti si dimostra che nel ceppo RSY6RAD52MSH2 l’espressione di BRCA1 WT non induce aumento di ricombinazione e di reversione; l’espressione di tutte le varianti influenza debolmente la ricombinazione, mentre l’espressione di una variante nel C-terminale aumenta la frequenza di reversione. <br>Nel ceppo RSY6rad52Δ, l&#39;espressione di BRCA1wt non influenza la frequenza di ricombinazione. In questo ceppo l’evento di reversione aumenta quando vengono espresse due varianti patogenetiche di BRCA1 e BRCA1 WT. <br>Nel ceppo RSY6msh2Δ, l’espressione della proteina BRCA1wt e di alcune varianti induce un forte aumento sia della ricombinazione che della reversione. L’espressione di due varianti patogenetiche non ha alcun effetto né sulla ricombinazione che sulla reversione. Questo suggerisce che il “mismatch repair” e, soprattutto il gene MSH2 hanno un ruolo nella instabilità genetica e presumibilmente nella cancerogenesi indotta da BRCA1. <br>Questi risultati indicano che la proteina BRCA1 influenza i “pathway” di riparazione del DNA in lievito. Poiché l’espressione di varianti missenso induce effetti diversi nei ceppi deficienti per la riparazione del DNA indica che presumibilmente questi pathway potrebbero essere fondamentali per la determinazione del rischio di tumore. <br>In conclusione il nostro studio dimostra che la genetica del lievito può dare un contributo per comprendere le basi genetiche della tumorigenicità dovuta a mutazioni di BRCA1. <br>
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