• gliomi
• Her2
• HSV ricombinanti
• modelli murini
• terapia virale

I gliomi sono un gruppo di tumori che colpiscono il sistema nervoso centrale, generalmente con prognosi infausta. I pazienti affetti da questo tipo di tumori, hanno una sopravvivenza di circa 10 mesi. Una delle principali caratteristiche dei gliomi è la loro elevata capacità infiltrativa che rende il trattamento chirurgico inefficace. Inoltre la chemio e radio-resistenza di questi tumori li protegge dagli attuali trattamenti farmacologici.
Un approccio terapeutico ideale per la cura dei gliomi dovrebbe essere in grado di colpire selettivamente le cellule tumorali e dovrebbe poter raggiungere anche le cellule migrate lontano dalla massa tumorale. A questo scopo è per prima cosa necessario individuare un bersaglio molecolare che permetta di distinguere le cellule da colpire dalle altre ed un mezzo con cui raggiungerle.
Fra i possibili caratteri distintivi dei gliomi vi sono vari recettori, tra cui quello dell’EGF, sia nella sua forma normale sia in altre varianti come una forma modificata costitutivamente attiva (EGFRVIII) o HER-2. Questi recettori potrebbero essere utilizzati quindi come un’etichetta molecolare per discriminare le cellule tumorali da quelle del tessuto sano circostante. Una possibile strategia per sfruttare tale etichetta è stata messa a punto nel Dipartimento di patologia sperimentale dell’Università degli Studi di Bologna, con cui collaboriamo. In tale laboratorio sono stati messi a punto degli Herpes virus oncolitici ricombinanti in grado di riconoscere il recettore HER-2 (HSV-aHER2) mediante l’inserimento nel rivestimento virale di un anticorpo a singola catena: le particelle virali risultano così reindirizzate selettivamente verso le cellule che esprimono HER-2 e sono in grado di infettare esclusivamente esse. Tali virus esprimono anche la proteina fluorescente GFP, in questo modo è possibile monitorare l’azione della particella virale.
Un approccio che faccia uso di simili virus per colpire tumori cerebrali non è mai stato provato prima, ed è stato quindi necessario farlo sia in vitro che in vivo. Ci siamo pertanto serviti di un modello murino di glioblastoma, prodotto nel laboratorio in cui sto svolgendo la tesi, il quale è ottenuto attraverso l’iniezione di vettori retrovirali codificanti per il PDGF-B in embrioni allo stadio E14. PDGF-B è un oncogene spesso sovraespresso nei gliomi umani e la sua trasduzione provoca l'insorgenza di tumori simili ai gliomi umani, facilmente riconoscibili in quanto il vettore utilizzato codifica anche per una proteina fluorescente (generalmente GFP o DsRed). Le linee cellulari ottenute da tali tumori possono essere mantenute in coltura ed essere facilmente ingegnerizzate mediante trasfezione, proprietà che le rende molto utili per i nostri scopi. Inoltre, in seguito a re-iniezione nel cranio di topi adulti, sono in grado di generare tumori secondari fluorescenti.
Lo scopo della mia tesi è stato quello di produrre colture cellulari derivate da tumori murini esprimenti il recettore umano HER-2 e di valutare su di esse gli effetti della viroterapia in vitro e in vivo. Ho trasfettato due diverse colture cellulari, ottenute da gliomi di topo indotti da PDGF-B/DsRed, con un plasmide codificante per HER2 e il gene di resistenza per la geneticina, che mi ha permesso di selezionare le cellule che esprimevano stabilmente il recettore. Abbiamo successivamente iniettato separatamente le linee cellulari ottenute, nel cranio di topi adulti, per verificare se l’espressione del recettore alterasse o meno la capacità di dare tumore. Il trapianto ha dato origine a tumori secondari e l’analisi immunoistochimica ha evidenziato il mantenimento dell’espressione di HER-2 nelle cellule tumorali.
Per saggiare la selettività dei virus ricombinanti, abbiamo infettato in vitro le colture cellulari da noi prodotte dimostrando che i virus HSV-aHER2 infettano le cellule che esprimono HER-2 ma non le cellule originarie che non lo esprimono. Al contrario il virus "wild-type" di controllo infetta le colture tumorali indipendentemente dall’espressione del recettore.
Due tipi di virus ricombinanti (113 e 249) preparati con strategie differenti sono stati poi esaminati per vedere la loro diversa capacità di propagarsi da cellula a cellula col passare del tempo. In seguito abbiamo trapiantato nel cranio di topi adulti ciascuna linea cellulare ingegnerizzata per HER-2 insieme alle varie tipologie di HSV, per testare la capacità del virus di infettare e di diffondere anche in vivo.
È in fase di preparazione un HSV ricombinante reindirizzato verso cellule esprimenti EGFRVIII, grazie alla elevata espressione di questo recettore nei gliomi umani, potrebbe essere una terapia effettivamente efficace. Linee cellulari tumorali trasfettate esprimenti questo recettore sono già state da noi stabilizzate, siamo in attesa quindi di testare i virus su di esse.