• glioblastoma multiforme aurora a chinasi PDK1 cell

Il glioblastoma multiforme (GBM) è la forma di tumore maligno intracranico più frequente. Tale tumore, che interessa prevalentemente la componente astrocitaria delle cellule del sistema nervoso centrale, è caratterizzato da alta aggressività e tendenza a dare recidive, associate alla rapida comparsa di farmacoresistenza. La terapia attuale, che si avvale dell’intervento chirurgico associato a terapia farmacologica (Temozolomide) e radiazioni ionizzanti, risulta inefficace, e l’aspettativa di vita nei pazienti affetti da GBM è di circa 12 mesi dalla diagnosi.
L’alta aggressività del GBM è stata associata ad alterazioni molecolari a livello dei meccanismi che controllano il ciclo cellulare ed i normali processi apoptotici. Tra queste, risulta alterata l’attività di due proteine fondamentali nella regolazione dei suddetti processi: Aurora-A (Aur-A), e la Phosphoinositide-dependent kinase 1 (PDK1). Aur-A è una serin-treonin chinasi, dotata di funzione regolatoria in numerosi meccanismi inerenti la divisione cellulare, e la cui espressione appare aumentata in molti tipi di tumore, tra cui il GBM, correlando con una peggiore prognosi. PDK1 è una serin-treonin chinasi coinvolta nella propagazione del segnale del pathway della phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), con effetti sul metabolismo energetico, sul differenziamento neuronale e sulla migrazione cellulare. Questo pathway risulta iper-attivato in circa l’80% dei pazienti affetti da GBM, contribuendo a conferire le notevoli capacità invasive di questo tipo di cellule tumorali.
Negli ultimi anni, inoltre, la ricerca oncologica ha messo in risalto il ruolo svolto da alcune cellule dotate di caratteristiche staminali (cellule staminali cancerose, CSC) nella genesi e nella progressione della malattia, oltre che nell’insorgenza di meccanismi di resistenza e di fenomeni recidivanti. Perciò è di cruciale importanza mettere a punto strategie terapeutiche anti-tumorali che abbiano come target anche la componente di CSC, al fine di garantire una remissione completa da questo genere di patologie. Aur-A e PDK1, oltre agli effetti precedentemente citati, sono risultate essere coinvolte nella proliferazione e regolazione delle CSC.
Sulla base di quanto detto, inibitori di Aur-A e PDK1 potrebbero rivelarsi una valida strategia terapeutica nel trattamento del GBM e della sua componente staminale.
In questo lavoro di tesi, si è voluto sperimentare a tale scopo l’inibizione simultanea di queste due proteine chinasiche, la cui espressione risulta aumentata nel GBM.
Si è quindi valutato l’azione di un nuovo derivato a struttura OXID (2-osso indolica/imidazolinica) piridonilica, SA16, sintetizzato nel laboratorio della Prof.ssa S. Rapposelli, del Dipartimento di Farmacia dell’Università di Pisa, capace di inibire contemporaneamente le chinasi Aur-A e PDK1, su una linea di cellule tumorali umane di GBM (U87MG) e sulle CSC da esse derivate, sotto forma di neurosfere. I benefici di un farmaco dotato di azione multitarged sono molteplici, e di recente comprensione da parte della comunità medica. La disponibilità di un unico principio attivo capace di agire a livello di più pathway, infatti, garantisce l’efficacia fornita da una terapia diretta su più bersagli terapeutici, eliminando tuttavia le criticità connesse all’assunzione simultanea di più farmaci. Tra queste la maggior prevedibilità dei parametri farmacocinetici di una singola sostanza; la maggior sicurezza, derivante dall’assenza di possibili interazioni farmaco-farmaco; una maggiore compliance del paziente dovuta alla semplificazione del regime terapeutico. Come confronto per valutare l’efficacia di SA-16, e per comprendere maggiormente il ruolo biologico svolto dall’uno o dall’altro pathway, sono stati utilizzati degli inibitori specifici delle due proteine, testati da soli ed in combinazione: Alisertib, inibitore di Aur-A, e MP7, inibitore di PDK1.
Per prima cosa, abbiamo valutato l’effetto di MP7 ed Alisertib sulla proliferazione delle cellule U87MG. Gli esperimenti hanno mostrato una scarsa attività antiproliferativa di tali composti quando testati singolarmente, a conferma dei risultati presenti in letteratura. La co-somministrazione dei due composti, al contrario, ha portato ad una inibizione significativa della proliferazione delle cellule tumorali. Il nuovo derivato ha mostrato effetti paragonabili alla combinazione Alisertib/MP7, confermando l’ipotesi di un effetto additivo/sinergico dettato dall’inibizione simultanea delle due proteine.
In seguito, si è voluto osservare l’effetto dei composti sulla componente staminale del GBM. A tale scopo, abbiamo realizzato un arricchimento delle colture di U87MG in CSC, sotto forma di neurosfere. L’efficacia del protocollo d’isolamento utilizzato è stata confermata grazie ad un’analisi quantitativa, tramite real time RT-PCR, sull’espressione di alcuni marker di staminalità convalidati in letteratura, quali CD133 e Nestin, e su un marker di differenziamento astrocitario, la proteina fibrillare acida della glia (GFAP). L’isolamento della componente staminale è stato inoltre confermato valutando la risposta delle U87MG e delle CSC alla Temozolomide. Le CSC sono risultate significativamente meno sensibili all’azione dell’agente alchilante rispetto alle U87MG, confermando la maggiore chemioresistenza della componente staminale. Una volta appurata la validità del metodo di isolamento, gli esperimenti di proliferazione eseguiti sulle U87MG sono stati ripetuti sulla componente staminale. La proliferazione delle CSC è risultata essere scarsamente alterata dall’inibizione di PDK1, mentre Alisertib, inibitore di Aur-A, ha determinato una riduzione della proliferazione delle CSC dose-dipendente, suggerendo un ruolo rilevante di questa proteina nella loro crescita. L’inibizione contemporanea delle due proteine ha infine causato una significativa diminuzione della proliferazione delle CSC dose-dipendente, in misura maggiore rispetto a quella osservata in seguito ai singoli trattamenti. Risultati paragonabili o sensibilmente maggiori si sono ottenuti con SA16, confermando un effetto additivo/sinergico dovuto all’inibizione concomitante di Aur-A e PDK1.
In seguito, è stata valutata anche la morfologia delle CSC dopo trattamenti con MP7 e/o Alisertib. Entrambi i composti, quando somministrati individualmente, hanno determinato una riduzione dell’area occupata dalle neurosfere, effetto particolarmente evidente nelle cellule trattate con Alisertib. In seguito al trattamento con Alisertib, inoltre, le CSC hanno mostrato una modesta ma significativa fuoriuscita di processi cellulari (neuriti), indice della capacità di questo composto d’indurne il differenziamento. Ancora una volta, l’inibizione simultanea delle due chinasi ha prodotto un effetto additivo/sinergico nella riduzione dell’area occupata dalle neurosfere. L’induzione di differenziamento è stata confermata valutando l’espressione dei marker di staminalità. Il nuovo derivato SA16 è risultato in grado di ridurre il numero di neurosfere con un effetto concentrazione-dipendente, e di indurre differenziamento delle CSC.
I dati ottenuti, hanno dimostrato che l’inibizione simultanea dei pathway regolati da Aur-A e PDK1, si traduce in una marcata riduzione della proliferazione delle cellule tumorali di GBM, e, fatto più significativo, della sottopopolazione staminale del tumore, tramite il suo differenziamento. Tutto questo a fronte di risultati non soddisfacenti quando l’inibizione è stata indirizzata verso una sola delle due proteine, a conferma degli scarsi effetti, già noti in letteratura, riguardanti l’attività antitumorale di composti inibitori di Aur-A o PDK1 selettivi, quando testati singolarmente. L’inibizione simultanea delle due proteine chinasiche, PDK1 ed Aur-A, si profila quindi come una valida strategia nel contrastare lo sviluppo del GBM.