• bacterial endotoxins test
• HACCP
• injections
• risk analysis

Le endotossine presenti nella membrana esterna dei batteri Gram negativi, possono avere un effetto pirogeno. Perciò le farmacopee stabiliscono che per i prodotti farmaceutici iniettabili si debba garantire un contenuto endotossinico tale da non determinare reazioni febbrili (E.P 5.1.10) e stabiliscono i metodi per la loro determinazione (E.P 2.6.14).
Il test delle Endotossine Batteriche (BET), comunemente conosciuto con il nome di LAL Test (Limulus Amebocyte Lysate Test), si basa sull’utilizzo di un lisato di amebociti derivante dall’emolinfa di Limulus polyphemus, il quale contiene enzimi che, in presenza di endotossina, si attivano a cascata dando luogo alla formazione di un coagulo. I metodi di farmacopea possono essere qualitativi o quantitativi e quest’ultimi possono essere turbidimetrici o cromogenici.
Lo scopo della tesi è stato quello di implementare una nuova piattaforma che consente la quantificazione delle endotossine batteriche con il metodo cinetico-cromogenico. La suddetta piattaforma, che usa cartucce precalibrate, è stata introdotta a fianco di una che si basa sul metodo cinetico turbidimetrico, e che è in uso dal 1995 e perciò risulta superata.
Dal momento che i recenti orientamenti della Comunità Europea in merito alle norme di buona fabbricazione suggeriscono l’introduzione dell’analisi del rischio a fianco delle GMP (ICH Q9, EU GMP), abbiamo deciso, ai fini di quanto precedentemente detto, di applicare l’analisi del rischio al processo di analisi a partire dal processing fino alla valutazione dei risultati e includendo la gestione dei reagenti.
Per l’analisi del rischio è stata applicata la metodologia HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Point) seguendo i suoi principi fondamentali e precedendola con una fase preliminare di studio del processo, come suggerito dal documento del WHO.
Per i seguenti Punti Critici di Controllo (CCP), che sono gestiti in maniera eccessivamente prudente a causa della mancanza di dati sperimentali e/o bibliografici, è stato deciso di eseguire delle prove sperimentali per verificare la possibilità di una gestione meno stringente, se possibile, e per stabilire i limiti e le modalità di monitoraggio:
- La conservazione dei diluenti, utilizzati per il BET, dopo l’apertura,
- L’utilizzo di materiali in plastica in aggiunta a quelli in vetro borosilicato
- La precisione di strumenti non certificati dal produttore, in particolare per la vetreria graduata
- Il tempo di conservazione di soluzioni campione e standard, una volta preparate
Inoltre l’impiego della nuova piattaforma per il BET, inizialmente utilizzata per la ricerca di endotossine nell’acqua distillata (WFI), ha portato alla necessità di verificare se fosse possibile utilizzarla anche per l’analisi su:
- Prodotti finiti (fiale con matrici iniettabili)
- Materie prime
- Superfici di lavoro
Come premesso, le prove, ad eccezione della vetreria graduata, sono state eseguite mediante test biologici, in cui sono stati analizzati campioni contaminati con endotossina standard e non, valutandone il recupero endotossinico e confrontando i valori di endotossina al tempo zero e al termine del periodo di conservazione.
I risultati sono i seguenti:
- Per i diluenti si è stabilito: il limite endotossinico (<0,005 UI/ml), il metodo per il controllo di qualità e le condizioni di conservazione (2÷8 °C, per 14 o 30 giorni a seconda del tipo di diluente).
- Per i materiali in plastica si è stabilito: il limite endotossinico (<0,005 UI/ml) e si è definito il metodo per il controllo di qualità.
- Per la vetreria graduata si è stabilito: la precisione accettabile ed il metodo per il controllo di qualità.
- Per i campioni è stato stabilito il metodo di analisi e il tempo di conservazione (≤ 3 ore) per il procedimento di analisi
- Per le superfici di lavoro si è stabilito il metodo di analisi.
In conclusione l’utilizzo dell’HACCP ha permesso di affrontare lo studio del processo di analisi finalizzato alla determinazione delle endotossine batteriche in maniera meno soggettiva e più mirata; consentendo di rilevare i punti critici, di mettere questi ultimi sotto controllo in maniera meno rigida, quando possibile e di determinarne le condizioni per il loro futuro monitoraggio (metodi, limiti e frequenza).