• identificazione mRNA target
• microRNA
• miR-28-5p
• miRNA Pull out assay
• tumore alla prostata

È oramai noto che perturbazioni dell'espressione dei microRNA (miRNA) possono essere causa o concausa dell'instaurarsi di patologie come il cancro, svolgendo il ruolo o di soppressori tumorali o di oncogeni. Studi preliminari effettuati nel nostro laboratorio hanno evidenziato che il miR-28-5p subisce una profonda sotto espressione nel processo di immortalizzazione nei fibroblasti embrionali murini e che la sua ri-espressione inibisce la proliferazione. Questi dati ,nel loro complesso, suggeriscono che il miR-28-5p sia un possibile soppressore tumorale.
Al fine di indagare questo aspetto abbiamo misurato il livello di espressione del miR-28-5p in diverse linee di tumore alla prostata, verificando che è marcatamente sottoespresso. Inoltre abbiamo visto che la sua ri-espressione induce una riduzione della proliferazione di tutte le linee cellulari analizzate.
Con lo scopo di determinare i geni che sono alla base dell’azione antiproliferativa del miR-28-5p abbiamo messo a punto e utilizzato il miRNA pull-out assay nella linea di tumore alla prostata androgeno indipendente DU-145. Questo metodo è basato sull’isolamento e l’identificazione dei complessi miRNA/mRNA target in cellule vitali. Dopo una fase iniziale durante la quale abbiamo apportato una serie di modifiche al protocollo originale, siamo riusciti ad ottenere un buon arricchimento dei complessi miRNA/mRNA target. La validazione dell’arricchimento è stata effettuata misurando, mediante qRT-PCR, l’arricchimento di target noti del miR-28-5p identificati in letteratura in altri contesti biologici. L’identificazione dei target del miR-28-5p è stata effettuata mediante tecnologia next generation sequencing (NGS) e dall’analisi dei dati sono risultati significativamente arricchiti 191 trascritti potenziali target del miR-28-5p.
Il target del miR-28-5p, noto in altri contesi biologici, risultato più arricchito dalla qRT-PCR è E2F-6. Per confermare che fosse un target del miR-28-5p anche nel tumore alla prostata, abbiamo sovraespesso il miRNA nelle DU-145 e dimostrato che la proteina di E2F-6 viene ridotta e che il processo di apoptosi, di cui E2F-6 è uno dei possibili mediatori negativi, viene indotto. Questi dati sono in linea con l'ipotesi iniziale secondo cui il miR-28-5p si comporta come TS-miRNA nel tumore alla prostata.
Il fatto che E2F-6 sia stato validato come target del miR-28-5p da un lato indica che il miRNA pull-out assay è capace di identificare i target molecolari di un TS-miRNA e dall’altro suggerisce che l’analisi degli mRNA target più arricchiti, una volta validati funzionalmente, permetterà di identificare e ricostruire le reti regolative in cui il miR-28-5p è coinvolto e attraverso le quali esplica la sua attività antiproliferativa nella cellule tumorali prostatiche.