• Bacillus cereus
• BATCH system kyt
• elettroforesi bidimensionale
• Emolisina BL
• FlhF
• Galleria mellonella

Bacillus cereus è un batterio bastoncellare, Gram-positivo, sporigeno, mobile per la presenza di flagelli peritrichi e noto per la sua capacità di provocare tossinfezioni alimentari ed infezioni più gravi, come periodontiti, endoftalmiti ed infezioni sistemiche. Questo microrganismo è capace, infatti, di produrre un’ampia varietà di enzimi e tossine, che contribuiscono alla patogenicità del microrganismo nei diversi tipi di infezioni.
Nell’ambito di uno studio mirato a comprendere i meccanismi molecolari che regolano la virulenza di B. cereus, il presente lavoro di tesi ha avuto l’obiettivo di studiare il ruolo della proteina FlhF nella secrezione proteica, in particolare di fattori di virulenza, e nella patogenicità di questo microrganismo. Nel laboratorio dove è stato svolto il lavoro di tesi, era stato precedentemente allestito un ceppo mutante nel gene flhF (MP06) derivato dal ceppo ATCC 14579 di B. cereus. Il gene flhF, identificato anche in altri microrganismi flagellati appartenenti ai generi Vibrio, Helicobacter, Campylobacter e Pseudomonas, codifica per una proteina citoplasmatica di 450 aminoacidi, che presenta una grande omologia con la famiglia proteica delle signal recognition particle (SRP). Queste proteine sono coinvolte nel trasporto alla membrana plasmatica di proteine che debbono essere esportate all’esterno della cellula o collocate all’interno della membrana stessa. L’analisi del ceppo MP06 aveva messo in evidenza numerose differenze rispetto al ceppo parentale, relativamente al numero ed alla posizione dei flagelli, alla motilità ed alla secrezione di alcuni fattori di virulenza, come l’emolisina BL (HBL) e la fosfolipasi C specifica per la fosfatidilcolina (PC-PLC). L’introduzione di una copia funzionale di flhF nel ceppo MP06 (ceppo MP07) ripristinava la posizione ed il numero di flagelli in mezzo liquido, nonché la secrezione delle tossine sopra citate.
Nella prima parte del lavoro di tesi, è stata effettuata un’analisi in silico della proteina FlhF di B. cereus. Tale analisi ha permesso di definire la struttura tridimensionale presuntiva della proteina, in cui è possibile individuare due porzioni distinte, costituite prevalentemente da α-eliche e collegate da un lungo filamento non strutturato. Inoltre, sono stati individuati in FlhF tre motivi aminoacidici conservati tra le proteine SRP-like (ALLEADV, GQ e DARGG) ed importanti per l’assemblaggio di FlhF e per il suo presunto ruolo di SRP.
In secondo luogo, è stata focalizzata l’attenzione sulla comprensione del ruolo di FlhF nella secrezione proteica di B. cereus. Pertanto, mediante elettroforesi bidimensionale, è stata effettuata l’analisi del profilo di proteine totali secrete (secretoma) dai ceppi wt (ATCC14579), MP06 ed MP07. I risultati ottenuti hanno rivelato che il ceppo mutante in flhF (MP06) presenta un profilo di secrezione proteica significativamente diverso rispetto al ceppo wt ed al ceppo portante la complementazione genica (MP07). In particolare, il ceppo MP06 secerne quantità ridotte di vari fattori di virulenza, tra i quali la componente L2 dell’HBL, le fosfolipasi, la citotossina K ed alcune proteasi. Il secretoma del ceppo MP07 è risultato sovrapponibile a quello del ceppo parentale, indicando l’avvenuta corretta complementazione genica.
E’ stato, inoltre, valutato se l’alterata secrezione di fattori di virulenza determinasse un ridotto potenziale patogenetico del ceppo MP06 rispetto agli altri in un modello di infezione nella larva Galleria mellonella. Le larve dell’insetto sono state sottoposte ad infezione intra-emocelica con diverse dosi infettanti dei ceppi in studio. Il calcolo della dose letale per il 50% delle larve (DL50) ha dimostrato che il ceppo mutante in flhF è significativamente meno patogeno del ceppo parentale e del ceppo portante la complementazione genica.
Infine, per cercare di comprendere la funzione di FlhF nella secrezione proteica di B. cereus, è stato allestito un saggio di interazione proteica tra FlhF e la componente L2 dell’HBL. Questa proteina è priva di un tipico segnale di esportazione Sec ed è un possibile target intracellulare di FlhF, poiché secreta in quantità minore dal ceppo mutante in flhF. I due geni codificanti le proteine oggetto sono stati amplificati dal genoma di B. cereus ATCC 14579 e clonati separatamente all’interno vettori plasmidici in modo che risultassero in frame con porzioni distinte del gene codificante la porzione catalitica dell’adenilato ciclasi, attività enzimatica impiegata come reporter per valutare l’eventuale interazione tra le due proteine. I risultati ottenuti dimostrano che esiste un’interazione diretta in vivo tra la componente L2 dell’HBL e la proteina FlhF. Tale evidenza avvalora fortemente l’ipotesi di un meccanismo di secrezione di L2 dipendente da FlhF.
In conclusione, nella presente tesi è stato dimostrato che la proteina FlhF di B. cereus è coinvolta nella secrezione proteica ed, in particolare, è richiesta per la corretta secrezione di alcuni fattori di virulenza. La presenza della proteina risulta, inoltre, essenziale per la piena patogenicità di B. cereus in un modello sperimentale di infezione.