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• terapia genica
• virus adeno-associati ricombinanti

I virus ricombinanti sono molto utilizzati per veicolare DNA, a scopo terapeutico, all’interno di una cellula. Un virus che trova largo impiego in questo campo è il virus adeno-associato (AAV). AAV è un virus non patogeno e difettivo, della famiglia dei Parvovirus, che necessita di una co-infezione da parte di un virus helper (solitamente adenovirus) per stabilire un’infezione nell’ospite e replicarsi attivamente. In assenza di virus helper, AAV si integra in modo sito-specifico nel genoma dell’ospite, stabilendo un’infezione latente. Il suo genoma a singolo filamento di 4,7kb è composto da due ORFs, Rep e Cap, che codificano rispettivamente per le proteine della replicazione e del capside. Le ORFs sono fiancheggiate da due sequenze terminali, invertite e ripetute (ITR), essenziali sia per la replicazione che per l’incapsidazione del virus. Uno dei problemi legati all’uso di AAV ricombinante (rAAV) nella terapia genica è rappresentato dalla difficoltà di produzione. Per mettere a punto una nuova strategia di produzione di rAAV nel lievito S.cerevisiae è stato dimostrato che, in questo organismo, il single-strand DNA (ssDNA) di AAV è prodotto da un plasmide contenente le ITR e che l’espressione delle proteine del capside porta alla formazione di “virus like particles” (VLP). é stato inoltre osservato che del DNA viene incapsidato nelle VLPs.
Il lavoro della mia tesi si propone di migliorare il metodo di purificazione delle particelle ricombinanti prodotte in lievito e di caratterizzare il DNA contenuto nelle VLPs.
Dal momento che i vettori ricombinanti di AAV (rAAV) che vogliamo produrre in lievito devono essere utilizzati per veicolare DNA nelle cellule umane, abbiamo costruito un vettore in cui tra le ITRs è presente non solo il marcatore URA3 di lievito ma anche il gene che codifica per la “Green fluorescent protein” (GFP) sotto il controllo del promotore CMV creando così il plasmide pAAVGFPURA. Abbiamo trasformato RSY12 contenente il gene Rep integrato con pAAVGFPURA, pESCVP2,3VP1KM ed il plasmide per l’espressione di E4orf6 ed E1b55k. Le VLPs prodotte in questo ceppo, sono state estratte e sottoposte a purificazione con gradiente di iodixanolo, che consente di purificare rAAV in maniera più rapida rispetto al gradiente di CsCl utilizzato in precedenza. La purificazione eseguita è risultata essere ancora imperfetta dal momento che nella frazione analizzata non erano presenti le VLP.
Era stato osservato precedentemente in laboratorio che il DNA viene incapsidato nelle VLP ma non era stato caratterizzato. Pertanto in questo lavoro abbiamo caratterizzato il DNA incapsidato e cercato di capire quanto ssDNA prodotto nella cellula venisse effettivamente incluso nelle VLPs. A tale scopo, siamo partiti da un ceppo già creato in laboratorio, contenente una delezione completa del gene URA3 ed il gene Rep integrato nel genoma, trasformato con il plasmide pAAVpokURA2μ, contenente la sequenza spaziatrice (pok) e URA3 (gene marcatore) fiancheggiate dalle ITR. Abbiamo poi indotto la produzione di proteine virali VP1, 2 e 3, trasformando il ceppo con un secondo plasmide, pESCVP2,3VP1KM, che consente l’espressione di tali proteine sotto il controllo di due promotori inducibile da galattosio (pGAL1 e pGAL10). La contemporanea presenza nella cellula di ssDNA e proteine del capside determina l’incapsidazione di DNA nelle VLPs. Per quantificare il DNA incapsidato abbiamo effettuato una real time PCR (RT-qPCR), ma i risultati ottenuti hanno indicato che il metodo non consente di misurare diverse quantità di ssDNA in presenza o assenza di capsidi.