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L’artrite reumatoide (AR) è una malattia infiammatoria cronica a patogenesi autoimmune che colpisce prevalentemente le articolazioni diartrodiali, anche se potenzialmente può coinvolgere ogni distretto dell’organismo
Gli anticorpi anti-proteine/peptidi citrullinati (ACPA) sono un gruppo di nuovi autoanticorpi presenti in più del 70% dei sieri di pazienti affetti da AR; tali autoanticorpi hanno una specificità molto elevata per la malattia (90-95%) tanto che sono raramente presenti in sieri di pazienti affetti da altre patologie o in soggetti sani.
Sebbene gli ACPA possano essere distinti in diversi tipi di autoanticorpi a seconda dell’antigene utilizzato per la loro individuazione, la citrullina è il componente critico comune del loro determinante antigenico. Tale aminoacido è il risultato di una modificazione post traslazionale (PTM) della catena laterale dell’arginina, catalizzata dall’enzima peptidil arginina deiminasi (PAD), un enzima calcio dipendente espresso in numerosi distretti corporei sotto diverse isoforme.
Tale PTM è coinvolta in numerosi processi fisiologici, quali la differenziazione cellulare, le interazioni proteine-lipidi nel sistema nervoso centrale ed il catabolismo proteico.
Un ruolo fondamentale è svolto, inoltre, dalla PAD nella regolazione genica: infatti, la deiminazione degli istoni previene la metilazione delle loro arginine e di conseguenza l’attivazione trascrizionale.
La massiva deiminazione degli istoni è, infine, un evento fondamentale per la produzione delle trappole neutrofiliche extracellulari (NET), reti di cromatina decondensata e proteine dei granuli neutrofilici che vengono formate durante i processi di morte cellulare indotta nei neutrofili in caso di attacco da parte di numerosi microorganismi.
Lo scopo fondamentale di questa tesi di laurea è stato quello di valutare se gli ACPA presenti nel siero dei pazienti con AR fossero in grado di reagire con gli istoni deiminati e se i NET prodotti dai neutrofili a seguito dell’attivazione di processi dell’immunità innata potessero risultare sorgente di istoni deiminati, target a loro volta di risposta autoimmune nei pazienti con AR.
A tale scopo, granulociti ottenuti da sangue periferico sono stati sottoposti a stimolazione con calcio ionoforo; da questi sono stati poi isolati i nuclei, dai quali è stata ottenuta, mediante precipitazione acida, una frazione acido-solubile fortemente arricchita in proteine istoniche.
Gli estratti acidi nucleari, separati mediante SDS-PAGE e trasferiti su PVDF mediante elettroblotting sono stati analizzati con anticorpi specifici per istoni e istoni deiminati e con i sieri dei pazienti con AR. I risultati indicano che i sieri di pazienti con AR contengono anticorpi diretti contro una proteina di peso molecolare compatibile con quello dell’H4 deiminato e che tale reattività è specifica per la proteina contenuta nell’estratto di granulociti stimolati con calcio ionoforo, quelli cioè in cui è stata indotta deiminazione.
Per valutare la possibilità che i NET prodotti dai neutrofili a seguito di stimoli specifici potessero risultare sorgente di istoni deiminati, abbiamo stimolato granulociti da sangue periferico con PMA (attivatore della protein chinasi C), con LPS, con H2O2 o A23187 (calcio ionoforo) e siamo andati a valutare la quantità di proteine deiminate prodotte e la possibilità che tali proteine fossero riconosciute dai sieri di pazienti con AR.
In tali esperimenti abbiamo osservato che i NET contengono istone H4 deiminato e che i sieri dei pazienti con AR riconoscono una proteina di mobilità elettroforetica compatibile con tale istone.
Questi risultati suggeriscono che i sieri di pazienti con AR contengono ACPA in grado di reagire con istoni deiminati prodotti nel corso di eventi di immunità innata.
Sono al momento in corso studi di sequenziamento mediante spettrometria di massa volti a caratterizzare in modo preciso le proteine deminate presenti nei NET e riconosciute dai pazienti con AR.