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• Xenopus laevis

L’oggetto del tirocinio è stato indagare l’effetto del gene Xbh1 sul patterning e sulla formazione della piastra neurale in Xenopus laevis .
Il gene Xbh1 è l’omologo di Xenopus del gene Bar H di Drosophila melanogaster. Il suo prodotto genico, la proteina Xbh1, è un fattore di trascrizione contenente un omeodominio. Xbh1 è espresso a partire dallo stadio di neurula. Trascritti di Xbh1 sono rilevati inizialmente in una ristretta regione corrispondente al diencefalo presuntivo e in una regione più posteriore della piastra neurale e del mesoderma dorsale in corrispondenza della linea mediana ( Offner et al 2005).; successivamente l’espressione si estende ad altre aree dell’encefalo mesencefalo e rombencefalo (Patterson et al., 1999). L’espressione a livello del mesoderma sembra correlata con fenomeni di EPCD ( early programmed cell death) che coinvolgono le cellule della piastra neurale ( Offner et al. 2005). A partire da bottone caudale (st. 26), Xbh1 viene anche espresso nella retina presuntiva; in questo contesto, esperimenti svolti nel nostro laboratorio hanno dimostrato che Xbh1 svolge un importante ruolo nella specificazione delle cellule gangliari (Poggi et a., 2004).
La proteina Xbh1 è soggetta a sumoilazione, una modificazione post-traduzionale che media vari processi quali la localizzazione nucleare, le interazioni proteina-proteina e la modulazione dell’attività di fattori di trascrizione. La sumoilazione avviene preferenzialmente, ma non esclusivamente, a carico di specifici siti di lisina (K) presenti in sequenze amminoacidiche definite sequenze canoniche di sumoilazione, la cui successione amminoacidica è Ψ( Psi)KXE. In corrispondenza di tali sequenze, un polipeptide di circa 100 aa, detto SUMO (small ubiquitin-related modifier) viene legato covalentemente alla proteina, ad opera di enzimi specifici. Esperimenti su cellule in coltura hanno confermato l’esistenza di quattro siti potenzialmente sumoilabili, due canonici e due non canonici. L’eliminazione, per mutagenesi sito-diretta, dei due siti canonici di sumoilazione, abolisce completamente l’attività di Xbh1 in retina.
Il presente lavoro di tesi mira a chiarire il possibile ruolo di Xbh1 sui geni del patterning espressi nella piastra neurale, estendendo i risultati ottenuti da Offner et al. (2005).
Mi sono dedicata ad esperimenti di microiniezione di mRNA di Xbh1 e ho verificato se la sua sovraespressione alterasse il pattern di diversi marcatori neurali precoci allo stadio di neurula (st. 15-16). In particolare ho esaminato Xotx2 (espresso inizialmente nella porzione anteriore della piastra neurale e a stadi più avanzati nel proencefalo, nel mesencefalo e nella retina), Xen2 (omologo di engrailed di Drosophila, espresso al confine tra mesencefalo e rombencefalo), Xkrox20 (espresso in due territori distinti già dallo stadio di neurula che diventeranno i rombomeri 3 e 5), Rx1 e Pax 6 (entrambi espressi nel territorio presuntivo della retina) e due marcatori pan neurali Xsox2 e N tubulina.
I risultati ottenuti dimostrano un generale effetto inibitorio di Xbh1 sugli altri geni presi in esame, anche se con alcune eccezioni per i marcatori del campo dell’occhio.
Dato che è stato dimostrato un ruolo importante della sumoilazione sulla attività biologica di Xbh1 nel differenziamento dei progenitori retinici, ho utilizzato dei costrutti mutanti di Xbh1in cui i siti di sumoilazione sono stati mutagenizzati nei residui di lisina dove normalmente avviene l’attacco di SUMO. I corrispondenti mRNA sono stati iniettati negli embrioni, allo scopo di verificare se la sumoilazione sia necessaria per l’attività e gli effetti di Xbh1 in piastra neurale. Inoltre ho prodotto costrutti mutanti per altri siti di sumoilazione non canonici e ho risultati preliminari anche per l’iniezione di questi mutanti.