• GFP
• localizzazione
• PARP-1
• riparazione DNA
• Saccharomyces cerevisiae

Nell’uomo, la Poli (ADP-ribosio) polimerasi-1 (PARP-1) è una proteina a localizzazione prevalentemente nucleare molto abbondante nelle cellule che possiede un'attività catalitica NAD+ dipendente che sintetizza un polimero carico negativamente chiamato poli (ADP-ribosio ) o PAR e lo trasferisce sulle proteine bersaglio. Svolge una serie di attività biochimiche distinte che la rendono ben adattata per i ruoli sia strutturali e regolatori in tutto il genoma. Gioca, infatti, un ruolo chiave in un’ampia varietà di processi che avvengono all’interno del nucleo della cellula, quali la trascrizione e la riparazione del DNA; inoltre, sembra sia coinvolta nel mantenimento della corretta struttura della cromatina. PARP -1 può legarsi a diverse strutture del DNA e ai nucleosomi. Poichè PARP regola la riparazione del DNA, inibitori di PARP sono usati come coadiuvanti nelle terapie antitumorali e antinfiammatorie. In pratica, quando l’attività di PARP è inibita, non si possono più attivare quei pathway che riparano il DNA e quindi, in presenza di danno al DNA la cellula muore per apoptosi. Durante la terapia, è stato osservato che un certo numero di pazienti diventa insensibile a tali inibitori. Alcuni studi hanno proposto vari modelli per spiegare il meccanismo di questa “resistenza”, ma il meccanismo molecolare ed i geni coinvolti non sono ancora completamente chiari. Comunque, un aumentato livello proteico intracellulare o un difetto nella localizzazione nucleare di PARP1 possono essere importanti per l’efficacia degli inibitori di PARP usati in terapia. Uno screening genetico utilizzando un pool di ceppi di lievito deleti per geni non essenziali effettuato nel nostro laboratorio ha permesso di identificare 110 geni che potrebbero interferire con le funzioni di PARP e quindi avere un ruolo nella sensibilità agli inibitori. In questa tesi abbiamo determinato il livello di PARP-1 e la sua localizzazione, nel ceppo BY4743 diploide ed in 6 ceppi di lievito Saccharomyces cerevisiae identificati mediante lo screening come “resistenti” all’ effetto inibitorio sulla crescita dovuto all’espressione di PARP-1. Questi ceppi sono tutti derivati dal parentale diploide BY4743 ed ognuno di questi presenta una delezione specifica in uno dei seguenti geni: GAL3 che codifica per una proteina che regola il metabolismo del galattosio, HHO1 che codifica per l’istone H1, HUL4 che codifica per una proteina con attività ubiquitina ligasica, OTU1 per una proteasi ubiquitina specifica , NUP che codifica per una proteina del poro nulceare e SNT1 per una proteina probabilmente implicata nel legame con il DNA. Queste funzioni potrebbero in qualche modo avere un ruolo nell’ attività di PARP e potrebbero influenzare la sua localizzazione e il livello intracellulare. Inoltre, queste proteine presentano il corrispettivo omologo umano. Lo scopo di questa tesi è quello di identificare nuovi geni che possano avere un effetto sulla risposta agli inibitori di PARP. L’obiettivo finale di questo progetto è quello di individuare nuovi target terapeutici per una terapia più personalizzata.Per prima cosa abbiamo determinato il livello di PARP-1 in tutti e 6 ceppi deleti e per confronto nel ceppo parentale . Esperimenti di Western Blot dimostrano che tutti i ceppi portanti la specifica delezione esprimono PARP-1. I risultati mostrano inoltre che il livello di PARP1 nei ceppi deleti è leggermente inferiore a quello determinato nel ceppo parentale wild type. Successivamente, abbiamo trasformato i tutti i ceppi deleti presi in esame con il plasmide pYES che permette l’espressione di PARP-1 fuso con GFP, in modo tale da osservare, tramite l’utilizzo del microscopio a fluorescenza, la localizzazione di tale proteina all’interno della cellula, e soprattutto vedere se in presenza di danno al DNA varia la sua posizione intracellulare. E’ stato riscontrato soprattutto nei ceppi deleti per HH01 e HUL4 un aumento del numero di cellule rispetto al wild type, in cui PARP1 si localizza nel nucleo, confermando l’ipotesi che tali geni possano interferire con le funzioni di PARP e quindi avere un ruolo nella sensibilità agli inibitori. Tramite l’utilizzo di un anticorpo anti anti-PAR, che permette di visualizzare il polimero di ADP ribosio , sintetizzato da PARP-1 abbiamo dimostrato che i ceppi producono il polimero indicando che le funzioni geniche oggetto di studio non interferiscono sulla attività specifica di PARP.Dalla letteratura è noto che PARP-1 è implicato in modo indiretto nella riparazione dei danni al DNA tramite il pathway del Base Excision Repair (BER). Poiché il ceppo di lievito RS112 contiene un sistema di ricombinazione intercromosomica e intracromosomica, che permette di misurare la frequenza di tali eventi direttamente su piastra abbiamo determinato se l’espressione di PARP-1 influenzasse tale ricombinazione. I risultati mostrano che l’espressione di PARP non influenza il livello di ricombinazione spontanea in lievito. Per determinare l’effetto di PARP sulla ricombinazione indotta danni al DNA sono stati effettuati esperimenti irradiando in ceppo RS112 con diverse dosi di raggi UV. I risultati preliminari indicano che l’espressione di PARP riduce la frequenza di ricombinazione indotta da UV confermando i dati ottenuti su linee cellulari di mammifero. In conclusione, questo lavoro di tesi si dimostra ancora una volta che il lievito Saccharomyces cerevisiae può essere considerato un sistema genetico modello per caratterizzare il meccanismo ed i fattori coinvolti che possono influenzare la risposta a farmaci usati nella terapia antitumorale.