• cromatografia ad esclusione molecolare
• frazioni della GGT biliare
• gamma-glutammiltransferasi biliare
• trattamento con acido desossicolico e/o papaina

La determinazione dell'attività della gamma-glutammiltransferasi (GGT) nel siero è un esame di laboratorio utilizzato per valutare la funzionalità epatica, poiché il suo innalzamento è stato osservato in seguito a colestasi, steatosi, abuso di alcool, ma anche in epatopatie virali ed epatocarcinoma. Nell'ultimo decennio, studi epidemiologici hanno evidenziato che la GGT rappresenta anche un fattore indipendente di rischio di mortalità per infarto del miocardio, e di insorgenza di sindrome metabolica, di diabete di tipo II.
In diversi studi è stata messa in evidenza l'eterogeneità della GGT sierica, infatti sono presenti diverse forme di GGT con caratteristiche chimico-fisiche diverse non ancora definite. Lo studio delle caratteristiche biologiche della GGT sierica e delle diverse frazioni sta acquisendo maggiore rilevanza affinché vi sia un miglioramento non solo nell'utilizzo diagnostico e prognostico di questo enzima ma anche per poter migliorare la comprensione delle malattie ad essa connesse (epatiche, metaboliche, cardiovascolari).
Nel laboratorio in cui è stata svolta la presente tesi, è stata messa appunto una tecnica che permette di separare quattro frazioni di GGT plasmatica tramite cromatografia per esclusione molecolare, e di rilevarne in modo selettivo e sensibile l'attività mediante una reazione enzimatica post-colonna. Cosi sono stati identificati tre complessi ad alto peso molecolare dotati di attività GGT, nominati big-GGT, (b-GGT; PM>2000 kDa), medium-GGT (m-GGT, PM=940 kDa), small-GGT (s-GGT; PM=140 kDa) e una quarta frazione, free-GGT (f-GGT; PM=70 kDa), con un peso molecolare compatibile con l'enzima libero. Questa tecnica ha come fine l'approfondimento dello studio della natura dei complessi responsabili del trasporto della GGT nel plasma. I dati ottenuti fin’ora (caratteristiche chimico-fisiche, suscettibilità a detergenti e all’azione proteolitica della papaina) supportano l’ipotesi che in b-GGT la proteina potrebbe essere inclusa in microvescicole (esosomi), m-GGT e s-GGT invece presentano un comportamento compatibile con la presenza di micelle di acidi biliari e GGT, e f-GGT è una forma di GGT solubile, priva del peptide idrofobico N-terminale.
La GGT sierica è riportato essere di origine prevalentemente epatica, come suggerito dagli studi condotti nel 1981 da Huseby e collaboratori nei quali è stato dimostrato che la GGT sierica presenta le stesse caratteristiche chimico-fisiche di quella estratta dal fegato.
Nel laboratorio in cui ho svolto il mio lavoro di tesi è stata condotta la caratterizzazione della distribuzione di tali frazioni nel plasma di soggetti con grave disfunzione epatica, prima e dopo il trapianto di fegato per valutare il cambiamento della distribuzione di GGT e delle sue frazioni nel primo periodo di ripresa della funzionalità dell'organo trapiantato.
Durante questo studio è stato possibile ottenere campioni di bile. Lo scopo di questo lavoro di tesi è stato descrivere la distribuzione della frazioni di GGT mediante la tecnica cromatografica. Nei campioni di bile analizzati è stato possibile visualizzare due picchi di attività di GGT, il picco di b-GGT e il picco di f-GGT.
Per la GGT presente nella bile sono stati condotti esperimenti volti alla determinazione della emivita dell'enzima e della stabilità in diverse condizioni di conservazione (temperatura ambiente, a 4 °C e a -20 °C ). I risultati ottenuti mi hanno permesso di stabilire che la bile può essere conservata per circa 7 giorni a 4°C La bile non può, invece, essere conservata a -20°C, poiché si ha la precipitazione di complessi presenti nella bile, con perdita di attività di GGT.
I campioni analizzati sono stati trattati con detergenti e/o papaina con lo scopo di verificare la presenza del peptide di inserzione di membrana, probabilmente responsabile del legame ai trasportatori. Utilizzando il metodo descritto precedentemente, ho confrontato i profili di eluizione dell'attività di GGT in un'aliquota di bile non trattata e in una trattata con papaina(è un enzima che serva ad idrolizzare la sequenza di inserzione di membrana), e ho osservato che nel campione trattato la b-GGT viene parzialmente ridotta, mentre f-GGT mostra un picco molto più alto rispetto al controllo. Dal confronto dei valori di area (proporzionale all'attività enzimatica) delle frazioni biliari si deduce che la proteina presente nella frazione della b-GGT è completa del peptide di inserzione di membrana e che la GGT solubilizzata, ha la stessa massa molecolare di f-GGT. Quest'ultima frazione è, quindi, costituita da una forma di GGT solubile, priva del peptide idrofobico N-terminale della catena pesante.
Il trattamento con acido desossicolico (Doc 1%) e papaina mi ha permesso, invece, di visualizzare una completa riduzione del picco di b-GGT. L’attività della proteina solubilizzata dal picco di b-GGT viene recuperata quantitativamente nel picco di f-GGT.
La bile è stata trattata anche con il butanolo con lo scopo di eliminare la componente lipidica associata alle micelle di acidi biliari e GGT. Il trattamento con butanolo ha portato alla formazione di un picco di s-GGT. Il trattamento con il butanolo non è una condizione fisiologica, sapendo che il primo punto di modificazione radicale della bile è rappresentato dall’azione degli enzimi pancreatici nell’intestino, ho deciso di trattare la bile con la pancreatina (derivante dal succo pancreatico suino, contenente enzimi quali lipasi e protesi) poter cosi visualizzare l’azione della lipasi e delle proteasi sulla GGT biliare.
La GGT biliare non sembrerebbe essere suscettibile all'azione degli enzimi pancreatici presenti nella pancreatina, ed inoltre poiché nella pancreatina si ha un’elevata attività di GGT, questa interferisce con l’esecuzione e l’interpretazione dei risultati.
Quindi per cercare di definire in particolare l’azione della lipasi sulla GGT biliare, ho trattato la bile con la lipasi porcina purificata. Questo trattamento porta ad una perdita di attività di b-GGT, ma non sembra comportare un riarrangiamento del complesso di b-GGT che sussiste in soluzione.
Si pensa che la b-GGT biliare possa essere costituita dall'enzima associato sia a micelle di acidi biliari, poiché è risultata essere parzialmente suscettibile all'azione della papaina, e sia da esosomi visto che la b-GGT è totalmente suscettibile al trattamento con Doc 1% e papaina.