• cellule natural killer
• Mycobacterium bovis bacillo di Calmette e Guérin
• recettori cellulari

Le cellule natural killer (NK) rappresentano circa il 10% dei linfociti del sangue periferico dell’uomo e sono caratterizzate dalla mancanza del marcatore CD3 e dall'espressione del marcatore CD16 e/o CD56. Sebbene inizialmente descritte per la loro spiccata attività citotossica nei confronti di cellule infettate da virus o di cellule tumorali, è oggi noto che tali cellule svolgono funzioni immunitarie importanti anche nei meccanismi di difesa innati contro agenti patogeni batterici. Una delle più importanti acquisizioni della biologia delle cellule NK negli ultimi anni è stata quella che ha evidenziato che l'attività di tali cellule è il risultato di un delicato equilibrio tra stimoli attivatori e stimoli inibitori mediati da altrettanti recettori cellulari. I recettori inibitori includono i Killer immunoglobin-like receptors (KIR) che, riconoscendo molecole MHC di classe I sulle cellule target, inibiscono l’attivazione delle funzioni citotossiche. Tra i recettori attivatori hanno recentemente acquisito particolare importanza quelli appartenenti alla famiglia dei natural citotoxicity receptors (NCR) che includono tre molecole, NKp30, NKp44, NKp46, espresse esclusivamente da cellule NK e coinvolte nel riconoscimento di ligandi microbici e/o cellulari ancora in gran parte da caratterizzare. Recentemente si sono, inoltre, accumulati dati sperimentali che dimostrano che le cellule NK possano esprimere anche alcuni membri della famiglia dei Toll-like receptors (TLR), suggerendo che esse possano, al pari di altre cellule dell’immunità innata, riconoscere ed interagire direttamente con gli agenti patogeni.
Studi precedenti, effettuati nel laboratorio in cui è stato svolto il lavoro di tesi, hanno dimostrato che Mycobacterium bovis bacillo di Calmette e Guérin (BCG), un ceppo attenuato di M. bovis, usato correntemente come vaccino antitubercolare, è in grado di interagire direttamente con cellule NK umane, inducendo la produzione di IFN-gamma, la proliferazione e l’attività citotossica di tali cellule.
Scopo del presente lavoro di tesi è stato quello di studiare i possibili recettori cellulari coinvolti nel riconoscimento di BCG da parte di cellule NK umane e, probabilmente, responsabili dell’attivazione delle loro funzioni effettrici in risposta al microrganismo.
A tale scopo, popolazioni cellulari altamente purificate di cellule NK sono state ottenute da sangue periferico di soggetti sani per selezione negativa mediante l’uso di biglie magnetiche commerciali. In seguito a stimolazione in vitro per vari intervalli di tempo con BCG vivo, è stata valutata l’espressione di superficie di TLR e NCR, mediante colorazione con anticorpi monoclonali ed analisi in citofluorimetria a flusso. I risultati ottenuti non hanno evidenziato alcuna espressione di superficie di TLR-2 e TLR-4 (due recettori toll-like per i quali è stata dimostrata l’esistenza di ligandi micobatterici) a nessuno dei tempi analizzati né su cellule NK non stimolate né dopo stimolazione con BCG. Al contrario, BCG è risultato in grado di indurre l’espressione di superficie del recettore NKp44, ma non degli altri due recettori appartenenti alla stessa famiglia, NKp30 e NKp46. Tale induzione, valutata come intensità di fluorescenza media (MFI), era evidente a partire da 3-4 giorni di stimolazione con BCG quando i valori di MFI per tale recettore risultavano statisticamente più elevati rispetto alle cellule non stimolate. L’induzione di NKp44, inoltre, era principalmente ascrivibile ad una particolare sottopopolazione di cellule CD56+ che esprime tale marcatore ad alta densità, le cellule CD56bright.
Allo scopo di valutare se l’induzione da parte di BCG di NKp44 su cellule NK isolate potesse essere dovuta ad un’interazione diretta del batterio con tale recettore, forme solubili di tutti e tre i recettori NCR, chimera per il frammento Fc delle immunoglobuline G umane (IgG), disponibili commercialmente (NKp30Fc, NKp44Fc, NKp46Fc), sono stati incubati con un ceppo di BCG vivo, ricombinante per il gene codificante per la green fluorescent protein (gfp), a disposizione del laboratorio. L’eventuale legame recettore-batterio è stato rilevato mediante colorazione con un anticorpo secondario di capra diretto contro il frammento Fc delle IgG umane marcato con ficoeritrina (PE) ed analisi in citofluorimetria a flusso a due colori dei complessi. I risultati ottenuti hanno dimostrato che, rispetto al controllo negativo, rappresentato dai batteri incubati in presenza di IgG umane e successivamente con l’anticorpo secondario, i batteri trattati con NKp44Fc solubile mostravano un netto incremento della fluorescenza corrispondente al fluorocromo PE, al contrario di quanto osservato con i batteri incubati con la forma solubile di NKp30Fc e di NKp46Fc. In particolare, la fluorescenza media dei batteri trattati con NKp44Fc era di almeno 50 volte superiore rispetto a quella del controllo negativo. Analoghi saggi di binding hanno dimostrato che NKp44Fc era in grado di legarsi anche ad altre specie di micobatteri, quali M. smegmatis, M. avium e M. tuberculosis, ma non a Streptococcus pyogenes (es di batterio Gram-positivo) o a Salmonella enteritidis (es di batterio Gram-negativo).
Allo scopo di verificare se il legame tra NKp44Fc e BCG, evidenziato tramite citofluorimetria, potesse essere confermato con un approccio metodologico diverso, BCG incubato con tutti e tre i recettori NCR solubili è stato trattato con anticorpi, marcati con particelle d’oro colloidale, diretti verso il frammento Fc delle immunoglobuline umane. Le varie sospensioni batteriche sono state quindi osservate mediante microscopia elettronica a trasmissione che ha rivelato una netta positività, costituita da microparticelle d’oro distribuite uniformemente su tutta la superficie del batterio, sui batteri incubati con NKp44Fc, ma non con gli altri due NCR.
Nel loro insieme, i risultati ottenuti dimostrano che: i) l’interazione diretta di BCG vivo con cellule NK umane altamente purificate induce su quest’ultime l’espressione di superficie di NKp44, ma non di NKp30, NKp46, TLR-2 e TLR-4; ii) NKp44Fc, ma non NKp30Fc e NKp46Fc, in forma solubile formano complessi con BCG vivo, suggerendo l’esistenza di ligandi micobatterici per tali recettori cellulari; iii) il putativo ligando per NKp44 sembra conservato nell’ambito del genere Mycobacterium, ma non in almeno due specie di batteri Gram-positivi o Gram-negativi. Il legame diretto del germe a tale recettore cellulare potrebbe indurne l’espressione ed, eventualmente, da solo od in combinazione con altri recettori cellulari, attivare le funzioni cellulari delle cellule NK.