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Tesi etd-02092007-122716


Thesis type
Tesi di laurea vecchio ordinamento
Author
Catalucci, Valentina
URN
etd-02092007-122716
Title
MESSA A PUNTO DI UN METODO PER LA COLTIVAZIONE DI CELLULE DENDRITICHE FELINE PER USO IN IMMUNOTERAPIA E CARATTERIZZAZIONE
Struttura
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE BIOLOGICHE
Supervisors
Relatore Dott.ssa Freer, Giulia
Parole chiave
  • cellule dendritiche
  • dendritic cells
Data inizio appello
26/02/2007;
Consultabilità
Completa
Riassunto analitico
1. RIASSUNTO



Le cellule dendritiche (DC) sono le pi¨´ potenti cellule presentanti l¡¯antigene (APC) che possono dare inizio alla risposta immunitaria, attivando i linfociti T vergini, e polarizzandola verso il tipo Th1 o Th2.
Nell¡¯uomo e in altre specie animali, i progenitori delle DC si ritrovano nel sangue periferico come monociti CD14+ che possono essere indotti a differenziarsi in DC, coltivandoli in presenza di granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) e di interleuchina 4 (IL4). Le DC si trovano nella periferia del sistema immunitario sotto forma di cellule immature, la cui capacit¨¤ ¨¨ quella di catturare l¡¯antigene (Ag) mediante fagocitosi e endocitosi mediata da recettore. Catturato l¡¯Ag, le DC risultano attivate e migrano ai linfonodi dove vanno incontro ad un ulteriore maturazione. Dopo la maturazione, le DC presentano una ridotta capacit¨¤ di catturare l¡¯Ag, ma sono in grado di attivare e polarizzare la risposta immunitaria delle cellule T.
Poich¨¦ la risposta immunitaria di tipo Th1 ¨¨ stata associata all¡¯eradicazione dell¡¯infezione virale, l¡¯ applicazione terapeutica delle DC maturate in vitro e reinoculate in vivo viene studiata al fine di provocare una risposta immunitaria nell¡¯animale infetto.
Sono gi¨¤ stati descritti diversi studi in immunoterapia con DC generate ex vivo allo scopo di migliorare la protezione immunitaria sia contro il virus dell¡¯immunodeficienza della scimmia nei macachi che contro il virus dell¡¯immunodeficienza umana (HIV) nell¡¯uomo; inoltre sono stati fatti studi clinici nell¡¯uomo in cui le DC, caricate con Ag tumorali, sono state usate al fine di aumentare la risposta immunitaria contro tumori maligni.
Per quello che riguarda il gatto, l¡¯infezione da virus dell¡¯immunodeficienza felina (FIV) ¨¨ stata per molto tempo studiata come modello per AIDS umano, ma ancora oggi, si conosce molto poco del ruolo svolto dalle DC feline in questo contesto
Per ottenere le DC da monociti provenienti da sangue periferico sono stati valutati tre diversi metodi: purificazione su gradiente di Percoll, purificazione tramite MaCS e infine aderenza su piastra per 24 h.
Il grado di purezza e il numero di cellule ottenute mediante gradiente di Percoll e la difficolt¨¤ di far differenziare i monociti purificati mediante MaCS in plasma autologo ci ha indotto ad utilizzare l¡¯aderenza su piastra come metodo ottimale per la generazione di DC da PBMC felini.
I monociti, provenienti da sangue periferico, venivano fatti aderire su piastra per 24 ore in terreno con 3% di plasma autologo, dopo prove sia per testare il miglior tempo di adesione a 3, 6, 12 e 24 h, sia per scegliere il migliore supplemento a base di siero, e la sua concentrazione, al fine di ottenere il maggior numero di DC. Per essere certi che le DC feline entrassero in contatto con il minor numero possibile di Ag esogeni, ¨¨ stato evitato l¡¯utilizzo, in vitro, di FCS, utilizzando al suo posto il plasma autologo di gatto e sono state utilizzate solo citochine ricombinanti carrier-free di origine felina. I monociti coltivati in presenza di IL4 felina e GM-CSF felino per cinque giorni sono stati poi maturati lipopolisaccaride (LPS), fattore di necrosi tumorale ¦Á umano ricombinante (TNF ¦Á ), il poly (I:C), con piastrine feline attivate, CD40 ligand (CD40L) e interferone ¦Á umano ricombinante (IFN ¦Á), poich¨¦, in altre specie, tali stimoli inducono le DC a maturare. Dopo 48 ore dall¡¯aggiunta delle sostanze, le DC sono state analizzate al FACS sia per la loro dimensione e complessit¨¤, sia per l¡¯espressione di marker di superficie quali CD1a, MHC di classe II, il CD14 e il B7.1. In parallelo, ¨¨ stata analizzata la loro abilit¨¤ nel catturare l¡¯Ag mediante pinocitosi e endocitosi mediata dal recettore mannosio (MMR), o nell¡¯innescare alloreattivit¨¤ da parte di linfociti felini.
Nel presente lavoro di tesi sono state stabilite le condizioni ottimali per coltivare un numero congruo di DC feline per un futuro uso clinico in immunoterapia e/o immunoprofilassi.
Inoltre, ¨¨ stato individuato l¡¯LPS come stimolo migliore per indurre un¡¯efficiente maturazione nelle DC feline derivate da monociti.
Infine, sono stati selezionati i parametri che permettono di prevedere l¡¯abilit¨¤ delle mDC nell¡¯indurre una maggiore risposta immunitaria allo scopo di stabilire un protocollo per l¡¯uso di DC feline, in vivo, in esperimenti d¡¯immunoprofilassi/ immunoterapia; tali parametri sono risultati l¡¯MHC, gi¨¤ espresso sulle iDC e 10 volte maggiore sulle mDC, e il B7.1 espresso solo sulle mDC.
In assoluto, tuttavia, la capacit¨¤ di rendere le DC buone induttrici di allo reattivit¨¤ ¨¨ risultato il migliore correlato di maturazione.
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