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Tesi etd-02092007-122716


Thesis type
Tesi di laurea vecchio ordinamento
Author
Catalucci, Valentina
URN
etd-02092007-122716
Title
MESSA A PUNTO DI UN METODO PER LA COLTIVAZIONE DI CELLULE DENDRITICHE FELINE PER USO IN IMMUNOTERAPIA E CARATTERIZZAZIONE
Struttura
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE BIOLOGICHE
Commissione
Relatore Dott.ssa Freer, Giulia
Parole chiave
  • cellule dendritiche
  • dendritic cells
Data inizio appello
26/02/2007;
Consultabilità
completa
Riassunto analitico
1. RIASSUNTO<br><br><br><br>Le cellule dendritiche (DC) sono le pi¨´ potenti cellule presentanti l¡¯antigene (APC) che possono dare inizio alla risposta immunitaria, attivando i linfociti T vergini, e polarizzandola verso il tipo Th1 o Th2.<br>Nell¡¯uomo e in altre specie animali, i progenitori delle DC si ritrovano nel sangue periferico come monociti CD14+ che possono essere indotti a differenziarsi in DC, coltivandoli in presenza di granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) e di interleuchina 4 (IL4). Le DC si trovano nella periferia del sistema immunitario sotto forma di cellule immature, la cui capacit¨¤ ¨¨ quella di catturare l¡¯antigene (Ag) mediante fagocitosi e endocitosi mediata da recettore. Catturato l¡¯Ag, le DC risultano attivate e migrano ai linfonodi dove vanno incontro ad un ulteriore maturazione. Dopo la maturazione, le DC presentano una ridotta capacit¨¤ di catturare l¡¯Ag, ma sono in grado di attivare e polarizzare la risposta immunitaria delle cellule T.<br>Poich¨¦ la risposta immunitaria di tipo Th1 ¨¨ stata associata all¡¯eradicazione dell¡¯infezione virale, l¡¯ applicazione terapeutica delle DC maturate in vitro e reinoculate in vivo viene studiata al fine di provocare una risposta immunitaria nell¡¯animale infetto.<br>Sono gi¨¤ stati descritti diversi studi in immunoterapia con DC generate ex vivo allo scopo di migliorare la protezione immunitaria sia contro il virus dell¡¯immunodeficienza della scimmia nei macachi che contro il virus dell¡¯immunodeficienza umana (HIV) nell¡¯uomo; inoltre sono stati fatti studi clinici nell¡¯uomo in cui le DC, caricate con Ag tumorali, sono state usate al fine di aumentare la risposta immunitaria contro tumori maligni.<br>Per quello che riguarda il gatto, l¡¯infezione da virus dell¡¯immunodeficienza felina (FIV) ¨¨ stata per molto tempo studiata come modello per AIDS umano, ma ancora oggi, si conosce molto poco del ruolo svolto dalle DC feline in questo contesto<br>Per ottenere le DC da monociti provenienti da sangue periferico sono stati valutati tre diversi metodi: purificazione su gradiente di Percoll, purificazione tramite MaCS e infine aderenza su piastra per 24 h.<br>Il grado di purezza e il numero di cellule ottenute mediante gradiente di Percoll e la difficolt¨¤ di far differenziare i monociti purificati mediante MaCS in plasma autologo ci ha indotto ad utilizzare l¡¯aderenza su piastra come metodo ottimale per la generazione di DC da PBMC felini.<br>I monociti, provenienti da sangue periferico, venivano fatti aderire su piastra per 24 ore in terreno con 3% di plasma autologo, dopo prove sia per testare il miglior tempo di adesione a 3, 6, 12 e 24 h, sia per scegliere il migliore supplemento a base di siero, e la sua concentrazione, al fine di ottenere il maggior numero di DC. Per essere certi che le DC feline entrassero in contatto con il minor numero possibile di Ag esogeni, ¨¨ stato evitato l¡¯utilizzo, in vitro, di FCS, utilizzando al suo posto il plasma autologo di gatto e sono state utilizzate solo citochine ricombinanti carrier-free di origine felina. I monociti coltivati in presenza di IL4 felina e GM-CSF felino per cinque giorni sono stati poi maturati lipopolisaccaride (LPS), fattore di necrosi tumorale ¦Á umano ricombinante (TNF ¦Á ), il poly (I:C), con piastrine feline attivate, CD40 ligand (CD40L) e interferone ¦Á umano ricombinante (IFN ¦Á), poich¨¦, in altre specie, tali stimoli inducono le DC a maturare. Dopo 48 ore dall¡¯aggiunta delle sostanze, le DC sono state analizzate al FACS sia per la loro dimensione e complessit¨¤, sia per l¡¯espressione di marker di superficie quali CD1a, MHC di classe II, il CD14 e il B7.1. In parallelo, ¨¨ stata analizzata la loro abilit¨¤ nel catturare l¡¯Ag mediante pinocitosi e endocitosi mediata dal recettore mannosio (MMR), o nell¡¯innescare alloreattivit¨¤ da parte di linfociti felini.<br>Nel presente lavoro di tesi sono state stabilite le condizioni ottimali per coltivare un numero congruo di DC feline per un futuro uso clinico in immunoterapia e/o immunoprofilassi.<br>Inoltre, ¨¨ stato individuato l¡¯LPS come stimolo migliore per indurre un¡¯efficiente maturazione nelle DC feline derivate da monociti.<br>Infine, sono stati selezionati i parametri che permettono di prevedere l¡¯abilit¨¤ delle mDC nell¡¯indurre una maggiore risposta immunitaria allo scopo di stabilire un protocollo per l¡¯uso di DC feline, in vivo, in esperimenti d¡¯immunoprofilassi/ immunoterapia; tali parametri sono risultati l¡¯MHC, gi¨¤ espresso sulle iDC e 10 volte maggiore sulle mDC, e il B7.1 espresso solo sulle mDC.<br>In assoluto, tuttavia, la capacit¨¤ di rendere le DC buone induttrici di allo reattivit¨¤ ¨¨ risultato il migliore correlato di maturazione.<br>
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