• biofilm
• Candida albicans
• hLF 1-11
• peptidi antimicrobici

RIASSUNTO
Candida albicans è un lievito comunemente presente come commensale nella flora microbica dell’uomo, ma capace di comportarsi da patogeno opportunista in individui con alterata reattività immunitaria. È il più comune agente eziologico di micosi nell’uomo, responsabile di infezioni sia localizzate, che sistemiche. Tra i fattori di virulenza posseduti da questo microrganismo, uno dei più rilevanti in ambito ospedaliero è la capacità di produrre biofilm, definito come una comunità di cellule microbiche adese a un substrato e inglobate in una matrice extracellulare polisaccaridica. Le cellule sessili acquisiscono un fenotipo di farmaco-resistenza, dovuto in ampia parte alla struttura stessa del biofilm, dato che la matrice polisaccaridica funge da barriera fisica che impedisce il passaggio della maggior parte degli agenti antifungini tradizionali. Grazie alla capacità di produrre biofilm, C. albicans è spesso responsabile di infezioni associate a dispositivi medici quali cateteri, protesi e valvole cardiache, molto difficili da eradicare. Negli ultimi anni, si è assistito ad un sviluppo nello studio di approcci terapeutici alternativi all’uso dei comuni farmaci antimicrobici per contrastare infezioni biofilm-correlate. Tra questi, di particolare interesse sono i peptidi antimicrobici (AMPs), piccole molecole (10-50 aminoacidi) prodotte da tutti gli organismi della scala evolutiva, di cui costituiscono un meccanismo di difesa innata. Tra i vari AMPs, il peptide sintetico hLF (1-11), costituito dai primi 11 aminoacidi del dominio N-terminale della lattoferricina umana, ha mostrato una spiccata attività antimicrobica nei confronti di diverse specie batteriche e fungine, inclusa C. albicans. Tuttavia, il ruolo esercitato dal peptide sul biofilm prodotto da C. albicans non è stato ancora delucidato. In tale ottica, il presente lavoro di tesi si prefigge di valutare l’attività inibitoria del peptide hLF (1-11) nei confronti di biofilm prodotto da diversi ceppi clinici di C. albicans. Dieci ceppi di C. albicans isolati presso l’Azienda Ospedaliera-Universitaria Pisana e il ceppo di rifermento di C. albicans SC5314, tutti produttori di biofilm, sono stati sottoposti a genotipizzazone mediante RAPD-PCR, allo scopo di selezionare quattro ceppi rappresentativi per gli esperimenti di inibizione del biofilm. Il saggio di inibizione del biofilm è stato effettuato su piastra da 96 pozzetti a fondo piatto utilizzando come terreno di coltura RPMI 1640 addizionato con il 2% di glucosio, diluito 1:4 con il tampone NaPB (sodium phosphte buffer). La sospensione cellulare di lievito utilizzata per il saggio conteneva 1x106 CFU/ml e veniva incubata per 24 ore a 37°C in presenza di diverse concentrazioni del peptide hLF (1-11). Per ogni piastra, il biofilm prodotto era quantificato mediante: (i) valutazione della biomassa, misurando la densità ottica a 490 nm; (ii) analisi dell’attività metabolica tramite il saggio XTT/menadione e (iii) valutazione della vitalità delle cellule presenti nel biofilm, tramite scraping del pozzetto, semina su agar Sabouraud e conta delle unità formanti colonia (CFU/ml) dopo 24 ore di incubazione a 37°C. I risultati ottenuti dagli esperimenti di co-incubazione indicano che il peptide esercita a 24 ore una significativa riduzione del biofilm sia in termini di biomassa, che attività metabolica e numero di cellule presenti, per tutti e 4 i ceppi analizzati (P<0.05; P<0.001). E’ stato quindi valutato se il peptide esercitasse una azione anti-biofilm anche a tempi più precoci, ripetendo il saggio di co-incubazione a 90 minuti, 3 ore e 6 ore a 37°C. I risultati ottenuti indicano che l’azione del peptide inibisce significativamente la formazione di biofilm a partite da 3 ore di co-incubazione. Questi risultati suggeriscono l’ipotesi che il peptide possa agire inibendo le prime fasi di formazione del biofilm, in particolare la fase di adesione cellulare. Infatti, quando il peptide è stato saggiato su cellule pre-adese ai pozzetti per 90 minuti e 6 ore, ha mostrato una ridotta attività inibitoria dopo 24 di incubazione, rispetto alla co-incubazione con le cellule fungine, confermando l’ipotesi che il peptide eserciti la sua attività anti-biofilm principalmente inibendo l’adesione cellulare. Inoltre, i pozzetti contenenti biofilm trattato con il peptide hLF (1-11) e non trattato sono stati osservati al microscopio invertito dopo 24 ore di co-incubazione, allo scopo di valutare gli eventuali cambiamenti nella architettura strutturale del biofilm fungino indotti dal peptide. L’analisi delle immagini ottenute ha indicato chiaramente una inibizione della morfogenesi di C. albicans, con una riduzione dose-dipendente del numero di ife osservate nei pozzetti del biofilm trattato con il peptide, per tutti e 4 i ceppi di C. albicans analizzati rispetto al controllo. Infine, allo scopo di verificare il ruolo del peptide nella regolazione genetica del biofilm prodotto da C. albicans, è stata effettuata una analisi dei profili di trascrizione di geni associati alla fase ifale e coinvolti nella sintesi di matrice polisaccaridica, mediante qRT-PCR. I dati ottenuti hanno evidenziato una sotto-regolazione dei geni in studio indotta dal peptide, confermando quanto visto all’analisi microscopica. In conclusione, i risultati ottenuti in questo studio indicano che il peptide hLF (1-11) potrebbe essere un ottimo candidato per prevenire la formazione di biofilm da parte di C. albicans in ambito nosocomiale.

ABSTRACT
Candida albicans is an opportunistic fungal pathogen of humans with an increasing medical relevance, causing superficial as well as systemic infection in individuals with impaired immune response. One of the most relevant characteristic of C. albicans is the ability to produce biofilm, defined as a structured microbial community that is attached to a surface and embedded in an exopolymeric extracellular matrix. This polysaccharide matrix acts as a barrier for the sessile cells, preventing the entrance of most commonly used antifungal agents and, therefore, conferring drug resistance. Consequently, the ability to produce biofilm makes C. albicans one of the most common causative agent of infections associated with medical devices such as catheters, implants and heart valves. These infections are very difficult to eradicate. Recently, there is an increasing effort in developing alternative strategies aimed at eradicate biofilm-associated infections. In this regard, antimicrobial peptides (AMPs), small molecules (10-50 amino acids) conserved in several organisms as part of natural immunity, have widely been investigated as novel potential therapeutic agents.
Among AMPs, the synthetic peptide hLF (1-11), derived from the first 11 amino acids of the N-terminal domain of human lactoferricin, showed a strong antimicrobial activity against various bacterial and fungal species, including C. albicans. However, the role played by this peptide on biofilm production by C. albicans remains to be elucidated. For these reasons, the present work aims to evaluate the inhibitory activity of the synthetic peptide hLF (1-11) against biofilm produced by different clinical strains of C. albicans. Ten C. albicans clinical isolates, obtained from the Azienda Ospedaliera-Univerisitaria Pisana, and the reference strain SC5314 were genotyped by RAPD PCR, in order to select four different strains for biofilm-inhibition experiments.
The anti-biofilm assay was performed in a flat bottom 96-well plate using RPMI 1640 as a medium supplemented with 2% glucose, diluted 1 in 4 in NaPB (sodium phosphate buffer). A C. albicans suspension containing 1x106 cells/ml was co-incubated for 24 hours at 37 ° C in the presence of different concentrations of hLF (1-11).
For each plate, quantification of biofilm was assessed by: (i) evaluating the biofilm biomass, at490 nm; (ii) measuring biofilm metabolic activity using the XTT/menadione assay and (iii) evaluating the viability of sessile cells, by scraping biofilm embedded cells from each well, plating them on Sabouraud agar and counting the colony forming units (CFU/ml) following a 24 hour incubation at 37°C. The results obtained show that, after 24 hours, the peptide induces a significant reduction of biofilm, both in terms of biomass, metabolic activity or cell viability, for all 4 strains analysed (P <0.05; P <0.001). Next, in order to investigate whether the peptide could also exert its anti-biofilm activity at earlier stages, we repeated co-incubation assay for 90 minutes, 3 hours and 6 hours at 37°C. The results obtained indicate that the peptide significantly inhibits the formation of biofilm after 3 hours of co-incubation. These findings suggest that the peptide may act by inhibiting the biofilm formation at early stages, when C. albicans adhesion to the abiotic surface occurs. Indeed, when the peptide was tested on cells pre-adhered to the wells for 90 minutes and 6 hours, it showed a reduced inhibitory activity after 24 hours of incubation, compared to the co-incubation experiments. This result confirms the hypothesis that the peptide exerts its anti-biofilm activity mainly by inhibiting cell adhesion. Furthermore, biofilm treated/untreated with the peptide hLF (1-11) were observed at the inverted microscope, after 24 hours of co-incubation, in order to assess potential changes in the architecture of the fungal biofilm induced by the peptide. The images clearly revealed an inhibition in C. albicans morphogenesis: all four strains treated with the peptide exhibited a dose-dependent reduction in the number of hyphae, compared to untreated control. Finally, in order to assess the effect of hLF (1-11) on biofilm-related gene expression, we investigated the transcript levels of genes linked to hyphal development or polysaccharide matrix synthesis, by qRT-PCR. The data obtained showed a marked down-regulation of these genes, induced by the peptide, thus confirming previous microscopic analysis. In conclusion, despite further studies candidate for a potential use as C. albicans anti-biofilm agent, our results suggest that the peptide hLF (1-11) could be an excellent candidate to prevent biofilm formation by C. albicans.