• cinetica enzimatica
• GAMMA-GLUTAMILTRANSFERASI (GGT)
• monossido d'azoto (NO)
• NITROSOGLUTATIONE (GSNO)

RIASSUNTO

Il monossido d’azoto (NO•) è una specie chimica reattiva di natura radicalica.
L’NO è una molecola prodotta a partire dall’amminoacido L-arginina ed O2, in una reazione catalizzata da una famiglia di enzimi chiamata NO-sintetasi (NOS).
Nei sistemi biologici, l’NO agisce come messaggero intra ed inter-cellulare regolando numerosissime funzioni.
All’inizio si pensava all’NO come ormone paracrino e recentemente è stato dimostrato che questa molecola è in grado di esplicare la sua azione in siti più distanti da quello di produzione. Pertanto, l’NO, in quanto molecola molto reattiva, per svolgere la sua azione a distanza deve essere trasportato nel sangue da molecole che lo stabilizzano e che possano, quindi, rilasciarlo in siti lontani da quelli in cui è stato prodotto.
Per molti anni in terapie cardiovascolari sono state usati farmaci NO-donatori che vengono decomposti nell’organismo per liberare NO, in particolare la nitroglicerina, per la prevenzione e il trattamento di angina pectoris e il sodio nitroprussiato per il trattamento dell’ipertensione.
Fra gli NO-donatori, gli S-nitrosotioli (RSNO) sono molecole che possono sostituire i farmci di sintesi con vantaggio per gli organismi, in quanto, sono molecole biologiche e non estranee all’organismo.
Fra i nitrosotioli a basso peso molecolare di particolare interesse è il Nitrosoglutatione (GSNO).
Il GSNO è un addotto del glutatione con l’NO che si forma normalmente nelle cellule in condizioni fisiologiche e patologiche, in particolare, durante ischemia.
Il nostro laboratorio è particolarmente interessato al metabolismo del glutatione e dell’NO, pertanto è stato importante mettere a punto un metodo di facile esecuzione per il dosaggio del GSNO in campioni biologici.
E’ stato ipotizzato che il trasporto dell’NO avvenga in vivo tramite il GSNO che viene decomposto dalla γ-glutamiltranspeptidasi (γ-GT o GGT) secondo la reazione:
GSNO + accettore → CysGlyNO + γ-Glu-accettore
La GGT è un enzima localizzato sulla membrana plasmatica di molti tipi cellulari che catalizza il primo passaggio del processo di idrolisi del glutatione (GSH) attraverso la scissione del legame γ-glutamilico.
Il substrato naturale della GGT è il GSH.
Per l’analogia fra il GSH e il GSNO è stato supposto , in diversi lavori, che quest’ultimo possa essere substrato della GGT e pertanto, che l’enzima GGT possa avere un ruolo nel rilascio di NO dal GSNO.
Noi ci siamo occupati di verificare che il GSNO potesse essere un buon substrato della GGT.
In letteratura non esistono metodi in grado di dosare l’attività della GGT sul GSNO.
In questo lavoro di tesi e’ stato messo a punto un metodo per dosare il GSNO tramite la reazione con la GGT in presenza della glicilglicina (GlyGly) come substrarto accettore.
GSNO + GlyGly → CysGlyNO + γ-GluGlyGly (1)
CysGlyNO → NO + CysGlyox (2)

Poiche’ sia il GSNO che la CysGlyNO presentano il medesimo assorbimento a λ=334 nm è stato necessario accoppiare una reazione ancillare (2) che rilasciasse un prodotto il quale non avesse un picco di assorbimento a 334 nm. La reazione 2 si adegua perfettamente a questa necessità in quanto il prodotto CysGly non assorbe a quella lunghezza d’onda.
D’altra parte si sa dalla letteratura che la CysGlyNO viene rapidamente decomposta da Cu(II) a CysGlyox e NO, mentre il GSNO e’ stabile in presenza di Cu(II).
La reazione 2 è, dunque, quella che ci ha permesso di visualizzare la decomposizione del GSNO allo spettrofotometro seguendo la diminuzione di assorbanza del nitrosotiolo ad una lunghezza d’onda λ=334 nm.
Attraverso questo studio cinetico ci è stato possibile calcolare la KmGSNO = 0.374 ± 0.024 mM (a 37°C) e KmGG = 0.687 ± 0.063 mM. Questo dato, fino ad ora non riportato in letteratura, e’ risultato paragonabile con la Km del substrato naturale GSH (0.4 mM) già esistente in letteratura.
Pertanto, abbiamo dimostrato, in questo lavoro, che il GSNO e’ un substrato della GGT con affinità paragonabile a quella del GSH e che il GSNO tramite la GGT rilascia NO in presenza di CU++, il quale si ritrova nel sangue in concentrazioni fisiologiche sufficienti (dell’ordine di micromolare) a produrre la decomposizione della CysGlyNO.