• Acetil-L-carnitina
• apprendimento non associativo
• Hirudo medicinalis
• ibridazione sottrattiva soppressiva (SSH)

Questo lavoro sperimentale si inserisce in un progetto di ricerca finalizzato all’analisi degli effetti della Acetil-L-Carnitina (ALC) nel sistema nervoso della sanguisuga Hirudo medicinalis.
E’ noto che ALC migliora diversi aspetti dell’attività neurale determinando effetti di tipo neuroprotettivo, neuromodulatorio e influenzando alcuni aspetti del metabolismo neuronale. E’ inoltre emerso che il trattamento con ALC è in grado di agire sui livelli di attenzione, di apprendimento e di memoria in ratti anziani sottoposti a tests comportamentali.
Nonostante i numerosi studi sugli effetti di ALC, ancora molto poco è noto riguardo al meccanismo di azione con cui questa biomolecola agisce sulle cellule nervose. Allo scopo di indagare i meccanismi d’azione di ALC, abbiamo ritenuto interessante valutare gli effetti di ALC sul sistema nervoso di H. medicinalis. Questo Invertebrato rappresenta, da anni, un buon modello sperimentale per lo studio di vari aspetti del funzionamento del sistema nervoso e dei meccanismi alla base dell’apprendimento e della memoria. Per le ricerche, oggetto di questa tesi, è stato utilizzato il modello comportamentale dell’induzione al nuoto sul quale i processi di apprendimento non associativo sono stati ben caratterizzati.
In sanguisughe in cui sia stata eseguita una sezione del connettivo intergangliare tra la massa cefalica e il primo ganglio segmentale, l’applicazione, nella regione caudale, di uno stimolo test costituito da un singolo treno (durata 1,6 sec) di lievi impulsi elettrici (5 msec, 8,3 Hz, 0,8-1,6 V), determina un ciclo di nuoto con un intervallo di tempo pressoché costante tra l’applicazione dello stimolo e l’inizio dell’attività natatoria (latenza). La stimolazione ripetuta alla frequenza di 1 stimolo al minuto induce un progressivo aumento della latenza (abitudine), mentre l’applicazione di uno stimolo nocicettivo (brushing) sulla cute dorsale dell’animale determina un immediato accorciamento della latenza in risposta alla presentazione del successivo stimolo test sia in animali naïve (sensitizzazione), sia in animali precedentemente abituati (disabitudine). Esperimenti condotti precedentemente nei nostri laboratori hanno evidenziato che una singola somministrazione di ALC (1 mM e 2 mM) blocca l’instaurarsi della sensitizzazione e riduce la disabitudine nell’induzione al nuoto a partire da 2 ore dal trattamento; tali effetti permangono anche a distanza di 11 giorni dalla singola somministrazione.
Inoltre, da esperimenti in cui la stimolazione nocicettiva è stata sostituita con un’iniezione di 5HT 2?10-4 M, in grado di riprodurre gli effetti sensitizzanti e disabituanti del brushing, è emerso che ALC 2 mM è in grado di bloccare anche la sensitizzazione indotta da 5HT.
Partendo da tali osservazioni, in questo lavoro sperimentale, sono stati condotti esperimenti utilizzando concentrazioni decrescenti di ALC. In particolare, sono stati valutati gli effetti di ALC 0,5 mM, 0,1 mM e 0,05 mM sulla sensitizzazione e la disabitudine indotte da brushing; di ALC 1 mM, 0,5 mM, 0,1 mM, 0,05 mM e 0,01 mM sulla sensitizzazione indotta da 5HT e di ALC 2 mM, 1 mM e 0,5 mM sulla disabitudine indotta da 5HT. Per tutte le concentrazioni considerate, l’effetto di ALC è stato valutato a distanza di 2 ore, 6 ed 11 giorni dalla singola somministrazione della sostanza.
Questa prima serie di esperimenti ha dimostrato che ALC influenza la sensitizzazione e la disabitudine in modo dipendente dalla concentrazione e dal tempo considerati, con un effetto massimo osservato negli esperimenti condotti a distanza di 11 giorni dal trattamento con ALC 2 mM.
Allo scopo di valutare possibili targets molecolari di ALC, sono stati analizzati gli effetti di questa sostanza alla concentrazione di 2 mM sulla sensitizzazione e sulla disabitudine inducendo tali forme di apprendimento con 8-Br-cAMP 1 mM, un analogo permeabile del cAMP in grado di mimare l’effetto sensitizzante e disabituante del brushing quando iniettato, in singola somministrazione, negli animali. Da tali esperimenti è emerso che ALC 2 mM blocca la sensitizzazione indotta da 8-Br-cAMP già a 2 ore e fino a 6 ed 11 giorni dal trattamento. A 2 ore e 6 giorni dall’iniezione, ALC, invece, non interferisce con il processo di disabitudine indotto da 8Br-cAMP mentre, dopo 11 giorni dalla somministrazione si assiste, negli animali trattati con ALC, ad una riduzione del potenziamento della risposta comportamentale rispetto agli animali iniettati con soluzione fisiologica in seguito all’iniezione di 8Br-cAMP.
Sono stati, infine, valutati eventuali effetti di ALC sull’altra forma di apprendimento non associativo, l’abitudine. Gli animali sono stati sottoposti a sessione di abitudine a distanza di 2 ore, 6 ed 11 giorni dalla singola somministrazione di ALC 2 mM o di soluzione fisiologica. Dai risultati ottenuti è possibile affermare che ALC è in grado di modulare parzialmente l’abitudine: gli animali iniettati con ALC mostrano, a distanza di 11 giorni dalla somministrazione, un minor incremento della latenza al nuoto rispetto a quelli trattati con soluzione fisiologica.
Dall’insieme di questi risultati è emerso un dato sorprendente; una singola somministrazione di ALC determina effetti a lungo termine sulle forme di apprendimento non associativo: infatti, gli effetti di ALC sono evidenti anche dopo 11 giorni dal trattamento.
Ciò ha suggerito l’ipotesi che ALC determini una modulazione dell’espressione genica, nel sistema nervoso di H. medicinalis. Per verificare questo, è stata utilizzata la tecnica dell’ibridazione sottrattiva soppressiva (Suppression Subtractive Hybridisation, SSH), un’efficiente metodo che, tramite la costruzione di librerie sottrattive di cDNA, evidenzia patterns d’espressione genica modulati dal trattamento in esame. In particolare, l’efficienza della SSH consiste nella capacità di isolare anche i trascritti più rari, non evidenziabili con altre tecniche che analizzano patterns d’espressione genica. Un gruppo di sanguisughe è stato, quindi, sottoposto a iniezione di ALC 2mM mentre un altro gruppo è stato sottoposto a iniezione con soluzione fisiologica (controllo). A distanza di 11 giorni dal trattamento, sono state estratte le catene gangliari di entrambi i gruppi di animali ed è stato isolato l’RNA totale. Il cDNA è stato ottenuto utilizzando il BD SMART™ PCR cDNA Synthesis Kit (BD Biosciences, Clontech). Tramite l’utilizzo del PCR-Select™ cDNA Subtraction Kit sono state costruite le due librerie sottrattive di cDNA, forward e reverse, costituite, rispettivamente, dai trascritti la cui espressione è modulata positivamente o negativamente dal trattamento con ALC. Dopo aver valutato l’efficienza di sottrazione, i cDNA sono stati clonati e sottoposti a screening. Le sequenze dei cloni differenziali, ottenute con sequenziatore automatico, sono state analizzate mediante comparazione con le sequenze depositate in banca dati (GenBank), utilizzando programmi come FASTA e BLAST. In particolare, l’analisi dei cDNA differenzialmente espressi (confermati mediante RT-PCR relativa) riportati in questa tesi, ha mostrato omologia con sequenze codificanti proteine note, quali: la proteina Heat shock protein 90 (Hsp90), l’enzima biosintetico per il tiazolo, la proteina ?-actinina e l’enzima CYP26 metabolizzante l’acido retinoico. Ciò dimostra quindi che una singola somministrazione di ALC è in grado di modulare l’espressione genica in H. medicinalis.