• pronefro
• Xenopus laevis
• xpdzrn3

Il gene pdzrn3 (PDZ domain containing ring finger 3) codifica per una proteina contenente domini specializzati per mediare le interazioni con altre proteine: un dominio RING finger coinvolto in attività ubiquitinasica di tipo E3 e due domini PDZ. La sua sequenza è conservata in tutti i Vertebrati. Nel topo è espresso nel sistema nervoso centrale (SNC), nella regione del cuore, nei muscoli scheletrici, nel fegato e nel rene. Finora, i dati presenti in letteratura mettono in evidenza un ruolo di pdzrn3 nello sviluppo muscolare, in particolare nella rigenerazione dopo lesione, e nella plasticità sinaptica del SNC.
L’ obiettivo della mia tesi è quello di studiare la funzione di pdzrn3 nello sviluppo del rene; per comprendere la funzione di questo gene abbiamo utilizzato come organismo modello Xenopus laevis poichè possiede un rene embrionale molto semplice chiamato pronefro.
Nei Vertebrati il pronefro è il rene primitivo embrionale che, durante le fasi precoci di sviluppo, svolge sia la funzione escretoria sia la funzione di regolazione omeostatica degli ioni. Nell’adulto il pronefro verrà sostituito da un organo simile ma più complesso, il mesonefro, che, negli amnioti, subirà un ulteriore sviluppo che porterà al metanefro funzionale. Il pronefro si origina a partire dal mesoderma ed è costituito da tre componenti principali: il glomus, i tubuli e il dotto. Il glomus, che costituisce la porzione vascolare, ha la funzione di filtrare dalla circolazione gli scarti prodotti dall’organismo che poi verranno riversati nel nefrocele. I tubuli, che si originano a partire dal mesoderma laterale intermedio, hanno il compito di riassorbire dal nefrocele, tramite i nefrostomi, soluti organici e ioni, rilasciando invece nel dotto pronefrico i prodotti di rifiuto che verranno escreti tramite la cloaca. Grazie alla sua organizzazione anatomica il pronefro può essere considerato come l’unità funzionale minima del rene.
In Xenopus laevis, il pronefro si forma a partire dallo stadio embrionale 12,5 (gastrula tardiva) ed è completamente funzionale a stadi embrionali più tardivi (stadio 37-38).
L’analisi di espressione del gene xpdzrn3 (l’omologo di pdzrn3 di Xenopus) durante lo sviluppo, mostra un segnale specifico a livello di differenti regioni embrionali; già a partire dagli stadi più precoci analizzati (stadio 22-23) risulta espresso a livello dei somiti e del territorio presuntivo dell’occhio. Embrioni a stadio 23 mostrano inoltre espressione di xpdzrn3 a livello delle isole ematiche e nel territorio presuntivo di formazione del pronefro. Stadi più tardivi (fino a stadio 37-38), mostrano, oltre alle regioni embrionali sopra riportate, un segnale specifico anche in alcune regioni del SNC, nella regione dell’occhio, negli archi branchiali, nella vescicola otica, nel pronefro e nella cloaca.
Sono stati effettuati esperimenti di perdita di funzione utilizzando un oligonucleotide “morpholino” diretto contro una regione di mRNA di xpdzrn3, lingo circa 20 nucleotidi contenente il codone di inizio traduzione “ATG”. Il morpholino Mo-xpdzrn3, avente funzione di reprimere la traduzione di Xpdzrn3, è stato iniettato in embrioni a stadio di 2 cellule a livello della zona marginale, che è la zona presuntiva di formazione mesodermica. Gli embrioni iniettati sono stati ibridati tramite l’uso di alcuni marcatori pronefrici.
A stadio 37-38, abbiamo osservato una alterazione del “looping” dei tubuli prossimali e del posizionamento nefrostomico, nel lato iniettato rispetto al lato di controllo, messa in evidenza dai geni pax8, hnf1 e dal marcatore pan-pronefrico Na+/K+ ATPase. A stadio 22-23 i marcatori precoci del pronefro, pax8 e hnf1mostrano un'alterazione del loro dominio di espressione nell’area presuntiva di formazione del pronefro in seguito a iniezione di morfolino diretto contro xpdzrn3. Esperimenti di controllo effettuati con un morpholino “standard” disegnato su una sequenza umana non omologa a Xenopus, non hanno evidenziato alcuna significativa alterazione fenotipica a livello del pronefro, indicando la specificità dei fenotipi ottenuti con Mo-pdzrn3. Inoltre i saggi di “rescue”, effettuati utilizzando il trascritto pdzrn3 di Danio rerio, hanno evidenziato il recupero delle alterazioni osservate con i marcatori sopra citati.
In conclusione possiamo sostenere che xpdzrn3 ha un’espressione regolata e dinamica durante lo sviluppo del pronefro di Xenopus . Con i dati ottenuti dagli esperimenti di ” loss of function” ipotizziamo un ruolo di xpdrn3 nella regolazione dello sviluppo precoce del pronefro ( st. 22-23) e, a stadi più tardivi ( st.37-38), un possibile coinvolgimento di questo gene nello sviluppo delle anse prossimali dei tubuli pronefrici.