• CDKL5
• Encefalopatia epilettica infantile precoce tipo 2
• FRAP
• proteine di fusione
• Rett
• RICS

Riassunto

La sindrome di Rett (MIM 312750) è un disordine genetico del neurosviluppo che colpisce prevalentemente le bambine e ne rappresenta una delle cause più comuni di ritardo mentale (1 ogni 10000). Circa il 99% dei casi è di tipo sporadico, e solamente l’1% dei casi è di tipo familiare (Schanen et al, 1997). Oltre alla forma classica dovuta a mutazioni sul gene MeCP2 (Methyl-CpG-binding protein 2), riscontrate nell’85% dei pazienti, (Amir et al, 1999), sono state identificate altre due forme dovute a mutazioni sui geni Cdkl5 (cyclin-dependent kinase-like 5) e FoxG1 (Forkhead box G1). MeCP2 e Cdkl5 sono entrambi localizzati sul cromosoma X, mentre FoxG1 si trova sul cromosoma 14, di conseguenza la patologia colpisce prevalentemente il sesso femminile.
Le bambine affette dalla forma classica nascono apparentemente sane ed il loro sviluppo nei primi 6−18 mesi non presenta particolari difetti. Nei mesi successivi (intorno ai due anni), segue un periodo di arresto dello sviluppo mentale, con microcefalia, blocco della crescita e ipotonia, che conduce ad una fase di regressione, in cui le pazienti acquisiscono un comportamento di tipo autistico. Successivamente iniziano a comparire i primi disordini motori: perdità della coordinazione, aprassia, atassia e movimenti stereotipati delle mani. Frequenti sono anche i disturbi a carico dell’apparato respiratorio, i problemi posturali (rigidità, scoliosi e distonia), i disturbi delle funzioni autonome (costipazione, piedi cianotici, disfunzioni orofaringee) e quelli cardiaci (tachicardia e prolungamento dell’intervallo QT). I disordini comportamentali seguono la regressione mentale, e includono crisi di pianto, umore tendente al depresso, episodi di crisi di panico. Infine, in alcune forme compaiono crisi epilettiche di tipo tonico-clonico.
CDKL5 (cyclin-dependent kinase-like 5), è un gene che mappa nella regione p22 del cromosoma X, con elevata omologia di sequenza per i geni delle MAP
chinasi e delle chinasi-ciclina dipendenti (Montini et al, 1998). Il gene è composto da 23 esoni e codifica per una serina-treonina chinasi di cui esistono 4 forme di splicing alternativo:
1. L’isoforma I e l’isoforma II dell’ RNA messaggero differiscono per la presenza nell’isoforma II degli esoni facoltativi 1a e 1b situati nella 5’ UTR, e codificano entrambi per la stessa proteina di 115kDa, lunga 1030 amminoacidi.
2. L’isoforma III (isolata nel 2011) è una forma di splicing alternativo che include l’esone 16b; l’ RNA messaggero è composto da 23 esoni e codifica per una proteina di 120kDa, (più lunga di 41 amminoacidi al C-terminale) che risulta complessivamente formata di 1071 residui (Fichou et al, 2011).
3. L’isoforma IV, anch’essa isolata nel 2011, è una forma di splicing alternativo che termina con l’introne 18. Possiede quindi un’estremità C-terminale più corta, è formata di 960 residui ed ha un peso molecolare di 107kDa. (Williamson, Giudici et al. 2011).
Le isoforme I e II sono espresse, nel topo, a livello del muscolo scheletrico, del cervelletto, della corteccia, dell’ippocampo, dei bulbi olfattivi e, in minor misura, nel rene, nel polmone e nel cuore; sono assenti invece nel fegato. Le isoforme III e IV sono espresse soprattutto nel SNC; si ritrovano infatti quasi esclusivamente nel cervelletto, nella corteccia, nell’ippocampo e nei bulbi olfattivi, con bassissimi livelli di espressione anche nel fegato; sono assenti negli altri tessuti (Fichou et al, 2011).
L’ Encefalopatia Epilettica Infantile Precoce tipo 2, nota anche come Variante di Hanefeld o come Sindrome da Spasmi Infantili dominante legata all’X di tipo 2 è una variante della Sindrome di Rett causata da mutazioni su Cdkl5. In questa variante, oltre alle caratteristiche della forma classica, sono spesso presenti episodi di crisi epilettiche e spasmi infantili ad esordio molto precoce. La maggioranza dei pazienti è di sesso femminile, con quadri variabili di gravità a

causa del fenomeno di inattivazione dell’X; tuttavia sono noti anche casi, sebbene piuttosto rari, di individui di sesso maschile affetti dalla patologia.
Le mutazioni patologiche più frequenti sono le puntiformi C152F (G455T) , R175S (A525T) (Tao et al, 2004) e A40V (C119T) (Rosas-Vargas et al, 2008), tutte localizzate nel dominio chinasico della proteina. Una delle mutazioni patologiche che porta alla formazione di una proteina tronca è la S781fsx783, una mutazione frameshift che porta alla traduzione di una proteina di soli 781 residui (ΔC781). con un’estremità carbossi-terminale più corta.
Ad oggi, non è noto il ruolo fisiologico di CDKL5, e pochi studi sono presenti in letteratura riguardo la sua localizzazione intracellulare, l’ affinità per la cromatina ed il ruolo delle mutazioni nella patogenesi della malattia.
Lo scopo della mia tesi è quello di analizzare, in linee cellulari, la localizzazione subcellulare, il profilo di diffusione e l’affinità per la cromatina di hCDKL5 wild type (nelle isoforme da 115 kDa e da 107 kDa), comparandoli a quelli delle forme patologiche C152F, R175S, e delle forme troncate all’estremità carbossi-terminale ΔC525 (mutante di sintesi) e ΔC781. L’obiettivo ultimo è quello di formulare delle ipotesi sul ruolo di queste mutazioni nella patologia e di individuare domini importanti nella funzionalità della proteina.
A questo scopo, sono state effettuate delle trasfezioni transienti su cellule NIH-3T3 con dei costrutti in cui la Green Fluorescent Protein (GFP) è fusa in frame all’estremità ammino terminale di Cdkl5 wild type e dei suddetti mutanti. Una volta appurata la localizzazione subcellulare, sono state effettuate delle misure di FRAP e di RICS per valutare la cinetica di spostamento tra il nucleo e il citoplasma e il profilo di diffusività della proteina. Grazie all’impiego di queste tecniche, è stato possibile formulare delle ipotesi sul ruolo funzionale di CDKL5, e attraverso l’analisi delle alterazioni osservate nelle forme mutanti, sono stati evidenziati dei dominio importanti per il corretto funzionamento della proteina.

Abstract

Rett Syndrome (MIM 312750) is a genetically-based neurodevelopmental disorder that occurs almost exclusively in females; it represents one of the most frequent causes of mental retardation (1 in 10000). Among these, about the 99% of cases result to be sporadic, whereas familial recurrences of Rett Syndrome comprise only approximately 1% of the total reported cases (Schanen et al, 1997). Besides the classical form, caused by mutations in MeCP2 gene (Methyl-CpG-binding protein 2), which have been found in the 85% of the patients (Amir et al, 1999), more recently two other forms of the disease have been identified, linked to mutations on FOXG1 (Forkhead box G1)and CDKL5 (cyclin-dependent kinase-like 5) genes. MeCP2 and Cdkl5 localize both on X chromosome, while FoxG1 gene is localized on chromosome 14. For that reason the disease affects more girls than boys.
Girls affected by the classical form appear healthy at birth, and appear to develop normally up to 6-18 months of age. In the second year of life, it occurs a period of developmental stagnation, accompanied by microcephaly, growth deceleration and hypotonia, that leads to a regression phase, during which patients develop an autistic-like behavior. After that, patients start showing motor disorders, like loss of coordination, apraxia, ataxia, and, during this time, they generally develop stereotypic movements instead of propuseful use of hands. Respiratory abnormalities, postural problems (like rigidity, scoliosis and dystonia), autonomic disfunctions (constipation, cold blue feet, orofaringeal disorders) and cardiac problems (tachycardia and extension of QT interval) are also frequent. Behavioral alterations follow mental regression, and includes crying, low mood and panic attacks. Finally, in some variant forms patients develop tonic-clonic seizures.
CDKL5 (cyclin-dependent kinase-like 5) gene maps on p22 region of X chromosome, with an high homology with both MAP kinases and Cyclin-dependent kinase genes (Montini et al, 1998). The gene is composed by 23 exons, and it encodes for a serine-threonine kinase. 4 splice variant have been discovered:
1. Isoform I and isoform II of mRNA differ because of the presence, in isoform II, of two additional exons, exons Ia and Ib, located on 5’ UTR; they both encode for the same 115 kDa and 1030 amminoacids protein;
2. Isoform III (isolated in 2011) is a splice variant that includes the alternative exon 16b; the mRNA is composed by 23 exons, and encodes a 120 kDa protein, 41 amminoacids longer than the 115 kDa protein. This protein contains 1071 residues (Fichou et al, 2011).
3. Isoform IV, isoleted in 2011, is a splice variant that ends with intron 18. The protein has a shorter C-terminus, contains 960 residues and has a molecular weight of 107 kDa (Williamson, Giudici et al. 2011).
Isoform I and isoform II are expressed, in mouse, in skeletal muscle, cerebellum, cortex, hippocampus, olfactory bulbs and, at lower levels, in kidney, lung and heart; their expression is not detectable in the liver. Isoform III and IV are expressed at high levels in the SNC, in particular in cerebellum, cortex, hippocampus and olfactory bulbs and also in liver at very low levels; they are absent in all the other tissues.
Early Infantile Epileptic Encephalopathy-2, also known as Hanefeld Variant or as X-Linked Dominant Infantile Spasm Syndrome-2, is a variant form of Rett Syndrome caused by mutations on CDKL5 gene. In this variant form patients shows all the symptoms of the classical form, but, in addition, they frequently developed seizures and infantile spasms at early onset. The majority of patients are females, and shows a dramatically variable spectrum of symptoms because of the X-inactivation phenomenon; for this reason the seriousness of symptoms differs from case to case. By the way, in some cases, males can develop the disease too, because of the alterations of X chromosome ploidy number.
C152F (G455T) , R175S (A525T) and A40V (C119T) are the most frequent missense mutations that occurs in patients affected by Rett Syndrome. The most common truncating mutation is the frameshift mutation S781fsx783, that leads to the production of a protein truncated on amminoacid 781.
The physiological role of hCDKL5 is unknown. In literature there are only few studies that illustrate the subcellular localization of hCDKL5, the affinity for chromatin and enlight the role of mutations in the pathogenesis of the disease.
The aim of this paper is to analize the subcellular localization, the diffusive profile and the affinity for chromatin of wild type hCDKL5 (both 115 and 107 kDa) and of mutant forms C152F, R175S, ΔC525 and ΔC781 in cultured cells. The purpose is to formulate some hypothesis about the functional role of these mutations in the pathogenesis of the disease. We performed transient expression mediated by transfection on NIH 3T3 cells, using GFP (Green Fluorescent Protein)-tagged proteins. We enlighted the subcellular localization, and then we performed FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and RICS (Raster Image Correlation Spectroscopy) experiments to evaluate the kinetics of the shuttling between the nucleus and the cytoplasm and the diffusive profile of wild type and mutant proteins.
Thanks to these experiments, we formulated some hypothesis about the possible functional role of hCDKL5 and we found important domains that are basic to the correct functionality of the protein.