• antiossidanti lipofili
• dolicolo
• stress ossidativo

In precedenti ricerche erano stati valutati gli effetti sui livelli generali di dolicolo e di altri antiossidanti lipofili di membrana, di un aumento dello stress ossidativo, esponendo epatociti di ratto all’azione di due agenti in grado di generare radicali in sedi fra loro diverse: l’irraggiamento con radiazioni UV, che genera radicali in maniera casualizzata nello spazio, e il trattamento con CCl4 che genera radicali a livello del sito attivo dell’enzima NADPH-citocromo P450 reduttasi, prossimo alla regione centrale del bilayer lipidico dove si colloca il dolicolo. Scopo della mia tesi è valutare gli effetti sui livelli di dolicolo di un’ aggressione radicalica delle citomembrane a partire dall’ambiente idrofilo. A tal fine, verranno utilizzati epatoci isolati incubati in soluzioni contenenti sistemi perossidanti. Gli epatociti utilizzati nella ricerca, sono stati isolati secondo il metodo di Seglen (1), da ratti di 3 mesi di età. Dopo l’isolamento con collagenasi, le cellule sono state sottoposte a trattamenti di filtrazione, incubazione e centrifugazione per selezionare le cellule isolate e intatte (Seglen, 1976); dopodichè la sospensione cellulare risultante è stata divisa in due gruppi, l’uno rappresentante i controlli, l’altro costituito dalle cellule incubate con un sistema generatore di radicali. Ciascun gruppo, è stato ulteriormente suddiviso in aliquote, dalle quali sono stati effettuati in seguito i dosaggi dei livelli di dolicolo, vitamina E e ubichinone direttamente sulle cellule, e i TBArs (specie reattive dell’acido tiobarbiturico) dal surnatante. Le cellule appartenenti al gruppo di controllo, sono state incubate con una soluzione isoionica, costituita da NaCl 115 mM, KCl 5 mM, CaCl2 2 mM, KH2PO4 1mM, MgSO4 1,2 mM, MOPS 20 mM, acido piruvico 15 mM, e sono state mantenute in agitazione costante alla temperatura di 37°C per 0’, 5’, 10’, e 20’. Il secondo gruppo di cellule è stato incubato con una soluzione perossidante, costituita da NaCl 115 mM, KCl 5 mM, CaCl2 2 mM, KH2PO4 1mM, MgSO4 1,2 mM, MOPS 20 mM, acido piruvico 15 mM, FeSO4 18 μM, ADP 1,6 mM ed un sistema generante NADPH: NADP+ 0.18 μM, glucosio-6-fosfato 4 mM e glucosio-6-fosfato deidrogenasi 0,19 unità/ml (Hallinan et al., 1991), è stato mantenuto in agitazione costante alla temperatura di 37°C per 0’, 5’, 10’, 20’. In entrambi i casi, il volume di soluzione da aggiungere è stato calcolato rispettando il rapporto di 10^6 epatociti per ogni 2 ml di soluzione. Al termine dell’incubazione le cellule sono state prelevate e centrifugate per 4’ a 1600 rpm; è stato prelevato il surnatante per il dosaggio dei TBArs e le cellule sono state conservate a -80°C fino al momento del dosaggio.
Gli esperimenti sono in corso e permetteranno di valutare, posti a confronto con i risultati già acquisiti, se gli effetti dello stress ossidativo sugli antiossidanti lipofili varino o meno con la geometria dell’aggressione radicalica. Risultati affermativi forniranno una prova a sostegno dell’ipotesi che le difese antiossidanti delle membrane siano distribuite in modo da costituire un sistema spazialmente orientato.