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Il miR-26a e il miR-28-5p sono due miRNA con attività di tumor suppressor (TS) nel carcinoma prostatico (PCa), poiché sono sottoregolati in linee cellulari tumorali di prostata (sia androgeno-dipendenti che androgeno-indipendenti) ed una loro ri-espressione provoca una significativa diminuzione della proliferazione cellulare.
In un precedente studio effettuato presso il nostro laboratorio, sono stati isolati, mediante miRNA pullout assay, gli mRNA target dei due miRNA in una linea androgeno indipendente di PCa (DU-145). Questo tecnica, unita al sequenziamento di nuova generazione (NGS), ha consentito prima l’isolamento dei complessi miRNA/mRNA target in cellule vitali e successivamente l’identificazione dei target. Sono stati così ottenuti i target-omi dei due miRNA, costituiti da 191 target per il miR-28-5p e 1424 target per il miR-26a.
Il primo obiettivo di questo lavoro è stato quello di validare i due target-omi andando a verificare tramite qRT-PCR l’arricchimento di alcuni mRNA target all’interno dei campioni isolati mediante pullout.
Al fine di selezionare i target la cui regolazione fosse rilevante per l’azione TS dei due miRNA nel PCa, abbiamo associato alla riduzione della proliferazione cellulare (effetto osservato dopo la ri-espressione dei miRNA nelle DU-145) altri saggi funzionali. I dati ottenuti hanno suggerito che entrambi i miRNA esplicano la loro funzione di TS agendo a più livelli, sia diminuendo la vitalità cellulare e la capacità di migrazione, sia inducendo l’apoptosi e il blocco del ciclo cellulare.
Dal momento che la riespressione dei due miRNA non provoca un fenotipo predominante, abbiamo deciso di concentrare la nostra attenzione sui target implicati in pathway coinvolti nello sviluppo e/o nella progressione tumorale, identificandoli mediante metodi computazionali. Le analisi effettuate ci hanno consentito di selezionare BIRC5 dal target-oma del miR-26a e SREBF2 dal target-oma del miR-28-5p.
BIRC5 è una proteina essenziale per l’organismo, implicata nella regolazione della divisione cellulare e nella resistenza all’apoptosi indotta da chemioterapici. Al fine di dimostrare l’interazione funzionale tra il miR-26a e BIRC5 abbiamo sovraespresso il miRNA nelle DU-145 e verificato la sottoregolazione della proteina. Con lo scopo di indagare in quali degli effetti biologici provocati dalla riespressione del miR-26a la regolazione di BIRC5 svolgesse un ruolo rilevante, abbiamo silenziato il gene nelle DU-145 e analizzato i suddetti endpoint biologici. I risultati ottenuti indicano che la sottoregolazione di BIRC5 diminuisce significativamente la proliferazione e la vitalità cellulare, mentre lascia quasi del tutto inalterati il ciclo cellulare, l’apoptosi e la capacità migratoria delle cellule, suggerendo che il miR-26a agisca su queste vie attraverso la regolazione di altri target.
SREBF2 è un fattore di trascrizione importante per la regolazione dell’omeostasi del colesterolo, frequentemente sovraespresso nei pazienti affetti da carcinoma prostatico. Studi di perdita di funzione da noi effettuati hanno dimostrato che la sua inibizione riduce significativamente la proliferazione, la vitalità e la capacità migratoria della linea cellulare androgeno-indipendente DU-145. Inaspettatamente, la sovraespressione del miR-28-5p nelle DU-145 non ha determinato una sottoregolazione di SREBF2, suggerendo che il miR-28-5p non regola la proteina nel nostro contesto cellulare.
I risultati ottenuti ci hanno dimostrato che BIRC5 è uno dei mediatori dell’attività antiproliferativa del miR-26a e che SREBF2 agisce da oncogene nel tumore alla prostata, influenzando aspetti come la proliferazione, la vitalità e la migrazione cellulare. Inoltre, il miRNA pullout assay si è dimostrato una tecnica efficace per l’identificazione dei target molecolari di miRNA soppressori tumorali, in potenza possibili nuovi target terapeutici per la terapia antitumorale.