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Tesi etd-02042013-143900


Thesis type
Tesi di laurea specialistica LC5
Author
CAVALLINI, DILETTA
URN
etd-02042013-143900
Title
Ruolo delle beta-arrestine nelle vie di trasduzione del segnale del recettore GPR17
Struttura
FARMACIA
Corso di studi
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Commissione
relatore Dott.ssa Trincavelli, Maria Letizia
correlatore Dott.ssa Daniele, Simona
Parole chiave
  • trasduzione
  • GPR17
  • beta-arrestine
Data inizio appello
06/03/2013;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
06/03/2053
Riassunto analitico
Il GPR17 è un recettore accoppiato a proteine G (GPCR) strutturalmente e filogeneticamente correlato a recettori purinergici P2Y e leucotrienici. Questo recettore è accoppiato principalmente a proteine di tipo inibitorio Gi ed, in misura minore, a proteine di tipo Gq. Il GPR17 si classifica come un recettore dualistico, capace di rispondere a due distinte classi chimiche di ligandi: nucleotidi uridinici (UDP, UDP-glucosio) e cistenil-leucotrieni (LTD4, LTC4, LTE4), con affinità nell’ordine del micromolare e nanomolare, rispettivamente.<br>In condizioni fisiologiche, il GPR17 è principalmente espresso a livello del sistema nervoso centrale (SNC), particolarmente a livello dei neuroni, in un sottoinsieme di cellule precursori degli oligodendrociti (OPC). In condizioni patologiche, quali ischemia e lesioni al midollo spinale, si osserva un cambiamento sostanziale nella distribuzione spazio-temporale del recettore, a partire dal luogo dell’insulto: GPR17 funzionerebbe da “sensore” attivato dal danno, capace di promuovere l’iniziale morte cellulare a livello della lesione e, successivamente, rimodellamento, ricostituzione e ripresa funzionale del tessuto.<br>Studi recenti dimostrano che l’espressione del recettore aumenta progressivamente durante lo sviluppo degli OPC a oligodendrociti: GPR17 è maggiormente espresso quando viene raggiunta la fase di pre-oligodendrociti immaturi (circa 6 giorni di differenziamento in vitro), mentre scompare allo stadio di oligodendrociti maturi, quando le cellule sono capaci di produrre mielina. La drastica diminuzione di espressione del recettore, che si osserva a stadi intermedi di differenziamento, sembra necessaria affinché le cellule portino a completamento il processo di maturazione: la forzata espressione di GPR17 a livello dei pre-oligodendrociti comporta, infatti, una diminuzione dei processi di maturazione e mielinizzazione, mentre il silenziamento del gene che esprime la proteina favorisce la maturazione degli OPC a cellule mielinizzanti. Inoltre, a livello delle placche sclerotiche, tipiche di patologie demielinizzanti, è stato recentemente osservato che il GPR17 va incontro ad una up-regulation, avvalorando l’ipotesi di un suo coinvolgimento nella regolazione del processo di mielinizzazione, sia in condizioni fisiologiche che patologiche.<br>Sulla base di questi dati, è stato ipotizzato che, per consentire la completa maturazione degli oligodendrociti, il GPR17 debba andare incontro a fenomeni di desensitizzazione, internalizzazione e down-regulation. La desensitizzazione dei GPCR (ovvero la perdita di funzionalità recettoriale dopo stimolazione prolungata con agonisti), avviene generalmente attraverso un processo a due stadi fondamentali: la fosforilazione del recettore su residui aminoacidici di serina e treonina ad opera delle chinasi specifiche per i GPCR, le GRK, e il conseguente aumento di affinità del recettore per le β-arrestine, proteine citoplasmatiche adattatrici, che promuovono il distacco del recettore stesso dalla proteina G e la sua internalizzazione in endosomi.<br>Studi precedenti, effettuati su cellule di glioma umano transfettate stabilmente con il recettore GPR17, hanno dimostrato che, tra le diverse isoforme di GRK, la GRK2 e la GRK5 sono quelle primariamente coinvolte nella desensitizzazione di GPR17. In particolare, la GRK2 e in misura minore la GRK5 sembrano mediare la desensitizzazione del recettore in risposta a ligandi leucotrienici, mentre la GRK5 sembra essere prevalentemente coinvolta nella desensitizzazione indotta dai derivati purinergici. <br>L’obiettivo di questo lavoro di tesi è stato quello di studiare il ruolo delle β-arrestine nei processi di desensitizzazione e di trasduzione del segnale mediati dai ligandi purinergici e leucotrienici, agonisti del GPR17. Al fine di verificare l’associazione tra GPR17 e le due isoforme di β-arrestina, dopo stimolazione del recettore con le due classi di ligandi, abbiamo effettuato studi di co-immunoprecipitazione e Western Blot: i risultati ottenuti hanno dimostrato che, dopo stimolazione del recettore per 5 minuti con UDP-glucosio (100 μM) o LTD4 (100 nM), il recettore GPR17 associa fisicamente con entrambe le isoforme di β-arrestina. In particolare LTD4 induce associazione preferenziale del recettore con l’isoforma 1, mentre UDP-glucosio con l’isoforma 2.<br>È noto che l’arrestina, oltre ad essere direttamente coinvolta nell’internalizzazione dei GPCRs, ha un ruolo attivo nell’attivazione di pathways intracellulari, come ad esempio la cascata delle chinasi regolate da segnali extracellulari (ERK1/2), e può partecipare alla regolazione della trascrizione genica a livello nucleare. Sulla base di questi presupposti siamo andati a valutare se l’arrestina fosse coinvolta nella trasduzione dei segnali intracellulari attivati da GPR17 indagando in particolare il suo ruolo nel controllo dell’attivazione della via delle MAP-chinasi. Studi recenti dimostrano che queste proteine possono essere fosforilate e quindi attivate attraverso due distinte vie intracellulari: ad opera di proteine G (subunità βУ delle proteine Gi o subunità α delle proteine Gq) oppure attraverso le β-arrestine 1 e/o 2. Abbiamo quindi valutato gli effetti degli agonisti al GPR17, UDP-glucosio e LTD4, sul pathway di segnale delle ERK 1/2. I risultati hanno dimostrato che LTD4 induce un incremento rapido e transiente nella fosforilazione delle ERK 1/2, con un picco massimo di attivazione dopo 1min di stimolazione. Al contrario, in seguito a stimolazione del recettore con UDP-glucosio, la cinetica di attivazione delle ERK 1/2 risulta molto più lenta, con un picco a 15 min, e più prolungata. La differenza nelle cinetiche di attivazione delle ERK indotta dalle due classi di ligandi al GPR17 ha fatto ipotizzare diversi meccanismi intracellulari di regolazione di tali chinasi, dipendenti o dalle proteine G o dalle β-arrestine. Al fine di valutare se la fosforilazione delle ERK 1/2 indotta da UDP-glucosio e LTD4 fosse associata ad un meccanismo proteina G-dipendente o β-arrestina-dipendente, abbiamo effettuato esperimenti distinti per bloccare selettivamente una delle due vie. Per determinare il contributo del pathway Gi-dipendente, le cellule sono state pre-trattate con la tossina della pertosse (PTX), bloccante della proteina Gαi, prima della stimolazione con gli agonisti al recettore. L’inibizione della proteina Gi si è mostrata capace di bloccare completamente l’attivazione delle ERK indotta da LTD4, ma non quella indotta da UDP-glucosio. Successivamente siamo andati a silenziare separatamente le β-arrestine 1 e 2 attraverso la tecnica degli Small Interference RNA (siRNA) e abbiamo osservato come il silenziamento delle β-arrestine attenuasse i livelli di fosforilazione delle ERK 1/2 indotti da UDP-glucosio, mentre non alterasse l’attivazione delle ERK LTD4-mediata. Sorprendentemente, il silenziamento della β-arrestina 2 sembra indebolire la fosforilazione delle ERK dopo 1min di trattamento con LTD4, suggerendo l’esistenza di una componente iniziale β-arrestina 2-mediata nell’attivazione delle ERK tramite LTD4. <br>Nel complesso, questi dati dimostrano che ligandi purinergici e leucotrienici attivano le ERK 1/2 rispettivamente con un meccanismo prevalentemente proteina G-indipendente e proteina G-dipendente. Questo diverso meccanismo di attivazione delle ERK si è dimostrato avere un effetto importante sulla localizzazione sub-cellulare delle MAP-chinasi e un potenziale risvolto nella regolazione della trascrizione genica: se infatti l’attivazione di tali chinasi avviene con un meccanismo proteina G-dipendente le ERK prevalentemente traslocano al nucleo. Viceversa, quando l’attivazione è mediata dalle arrestine, le ERK si localizzano prevalentemente nel citosol. <br>Al fine di indagare quale sia la diversità funzionale che scaturisce dai due diversi meccanismi di attivazione delle MAP-chinasi, al momento sono in corso studi mirati a valutare la regolazione della trascrizione genica in risposta alle due classi di ligandi. Questo rappresenta il primo studio che dimostra che due classi di ligandi chimicamente e metabolicamente diversi, entrambi agonisti per lo stesso recettore, sono in grado di attivare vie di segnale intracellulari distinte e quindi potenzialmente regolare la trascrizione genica in maniera distinta.<br>
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