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• bahavioural assay
• Controllo biologico
• deep-learning
• entomopathogenic nematodes
• lab-on-chip
• microfluidica
• nematodi entomopatogeni
• studio comportamentale. Biological control

I nematodi rivestono notevole importanza in numerosi settori, il presente studio si focalizza sulla specie Steinernema carpocasae, un entomopatogeno descritto – dal punto di vista della modalità di ricerca dell’ospite - come ambusher. Questo entomopatogeno viene utilizzato come agente di controllo biologico (BCA) nell’ambito della lotta integrata a diversi pest di interesse agrario. Secondo la letteratura presente, i nematodi riescono a percepire stimoli biochimici anche da lunghe distanze e gli entomopatogeni sono risultati essere particolarmente attratti dal contenuto intestinale del potenziale ospite. In questa tesi è stato deciso di utilizzare come stimolo le feci di Lobesia botrana (Lepidoptera: Tortricidae), fitofago chiave del vigneto, e verificare se la loro presenza all’interno della micro-arena induce nei nematodi un cambiamento sia nella locomozione che nella gesture ovvero nell'insieme dei movimenti in sito che non comportano un effettivo spostamento tra due punti da parte dell'animale.
Il comportamento dei nematodi è stato osservato all’interno di un device microfluidico detto lab-on-a-chip (LOC) appositamente disegnato mediante software CAD 3D (SolidWorks). Questo approccio permette di gestire piccole quantità di fluido e minimizzare l’effetto di agenti esogeni oltre che ricreare la condizione ottimale per il movimento dei nematodi. Essi vengono studiati in movimento all'interno di soluzione fisiologica per evitare stress osmotici. Inizialmente il lavoro si è focalizzato sull'osservazione dei nematodi mediante microscopio invertito, così da individuare i principali comportamenti descritti anche in letteratura: ripiegamento a C, movimento sinusoidale, formazione di anelli e variazione della velocità. Successivamente è stato prodotto il dataset video per l'analisi mediante deep learning. Le prove sono state registrate con una videocamera RGB, la durata di ciascuna osservazione è stato di cinque minuti L’analisi del dataset è stata effettuata mediante un approccio multidisciplinare, che prevede l’utilizzo di software per il labelling delle immagini (MakeSense.AI) e di algoritmi di deep learning per effettuare il riconoscimento dei nematodi presenti nelle immagini. I nematodi sono analizzati in due scenari 0 (assenza di stimolo) e 1 (presenza di stimolo). Il dataset di analisi si compone di 1680 immagini che sono state divise secondo la ripartizione train (70% delle immagini), valid (20%), test (10%). L'analisi sulle immagini è stata iterata sui video e successivamente è stata effettuata una analisi di flusso ottico per calcolare la variazione di magnitudine, ovvero la presenza di movimento nei nematodi presenti in ogni video. Per questa fase è stato utilizzato un dataset di video ridotto a 1 minuto di lunghezza.
Nelle osservazioni preliminari effettuate sui video era già visibile una variazione nei pattern di movimento dei nematodi in presenza ed in assenza di stimolo. In presenza di quest’ultimo, è stato evidenziato un aumento della frequenza nel movimento ondulatorio rispetto al controllo e in numerosi casi si è presentata una locomozione verso l’attrattivo, le osservazioni sono state confermate dall’analisi mediante AI La rete neurale allenata con il dataset di immagini mostra di avere una precisione intorno al 60%, mentre il procedimento iterato sui video mostra la capacità della rete di discriminare i dati arriva ad una accuratezza del 87%, mostrando come i pattern di movimento dei nematodi siano diversi tra i due gruppi. L'analisi mediante optical flow è stata un'ulteriore riprova delle osservazioni, infatti l'analisi statistica mediante test parametrico t-Student ha rilevato una significativa differenza tra le due classi. I risultati ottenuti permettono di affermare l’efficacia di questa tecnica innovativa, che unendo osservazioni macroscopiche all’utilizzo di algoritmi di deep learning getta le basi per ricerche future sugli stimoli chimici che guidano il nematode nella ricerca dell’ospite.
Nematodes are of considerable importance in a number of areas; the present study focuses on the species Steinernema carpocasae, an entomopathogen described-from the point of view of its host-seeking mode-as an ambusher. This entomopathogen is used as a biological control agent (BCA) in integrated pest management of various pests of agricultural interest. According to the present literature, nematodes can sense biochemical stimuli even from long distances, and the entomopathogens were found to be particularly attracted to the intestinal contents of the potential host. In this thesis, it was decided to use as a stimulus feces of Lobesia botrana (Lepidoptera: Tortricidae), a key phytophagus in the vineyard, and test whether their presence within the micro-arena induces in the nematodes a change in both locomotion and gesture i.e., the set of in situ movements that do not involve actual movement between two points by the animal.
Nematode behavior was observed within a microfluidic device called a lab-on-a-chip (LOC) specially designed using 3D CAD software (SolidWorks). This approach allows handling small amounts of fluid and minimizing the effect of exogenous agents, as well as recreating optimal conditions for nematode movement. Nematodes were studied moving within a salt solution to avoid osmotic stress. Initially, the work focused on observing the nematodes using an inverted microscope so as to identify the main behaviors also described in the literature: C-folding, .sinusoidal movement, ring formation, and velocity variation. Next, the video dataset was produced for analysis by deep learning. The tests were recorded with an RGB video camera, the duration of each observation was five minutes. The analysis of the dataset was conducted through a multidisciplinary approach, involving the use of image labeling software (MakeSense.AI) and deep learning algorithms to perform nematode recognition in the images. Nematodes are analyzed in two scenarios 0 (absence of stimulus) and 1 (presence of stimulus).
The analysis dataset consists of 1680 images that were divided according to train (70% of images), valid (20%), test (10%) breakdown. The analysis on the images was iterated on the videos and then an optical flow analysis was performed to calculate the magnitude change, i.e., the presence of movement in the nematodes present in each video. A dataset of videos reduced to 1 minute in length was used for this step.
In preliminary observations made on the videos, variation in the movement patterns of the nematodes was already visible in the presence and absence of stimulus. In the presence of the latter, there was evidence of an increase in frequency in the wavelike movement compared to the control, and in several cases locomotion toward the attractant was presented.The observations were confirmed by analysis using AI The neural network trained with the image dataset shows to have an accuracy of around 60 percent, while the procedure iterated on the videos shows the ability of the network to discriminate the data comes to an accuracy of 87 percent, showing how the movement patterns of the nematodes differ between the two groups. Analysis by optical flow was further proof of the observations, in fact statistical analysis by parametric t-Student test found a significant difference between the two classes. The results obtained allow us to affirm the effectiveness of this technique innovative technique, which by combining macroscopic observations with the use of deep learning algorithms lays the foundation for future research on the chemical stimuli that guide the nematode in its search for the host