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Tesi etd-01312015-192819


Thesis type
Tesi di laurea specialistica LC6
Author
FANELLI, GIUSEPPE NICOLO'
URN
etd-01312015-192819
Title
Analisi dell'intero trascrittoma di una serie di glioblastomi; meccanismi molecolari correlati alla sopravvivenza libera da malattia.
Struttura
RICERCA TRASLAZIONALE E DELLE NUOVE TECNOLOGIE IN MEDICINA E CHIRURGIA
Corso di studi
MEDICINA E CHIRURGIA
Commissione
relatore Prof. Naccarato, Antonio Giuseppe
Parole chiave
  • Glioblastoma
  • Trascrittoma
  • Recurrence Free Survival
  • Sopravvivenza libera da malattia
  • Meccanismi molecolari
  • Ion proton
Data inizio appello
24/02/2015;
Consultabilità
completa
Riassunto analitico
Il presente studio si colloca nell’ambito di un ampio progetto di ricerca multicentrico che vede coinvolti la Fondazione Pisana per la Scienza, l’Università di Pisa, l’Azienda Ospedaliero Universitaria Pisana, la Scuola Normale Superiore - NEST, l’Università di Cagliari e il Langone Medical Center della New York University. <br> Lo scopo principale di tale progetto sarà quello di caratterizzare da un punto di vista molecolare il glioblastoma e cercare di comprendere, sotto ogni aspetto, quali siano i fini meccanismi che regolano i processi di progressione neoplastica per poter identificare biomarcatori sensibili e specifici che possano avere una valenza prognostica e predittiva sia nell’ambito della prima diagnosi che nel follow-up.<br><br> Il glioblastoma rappresenta la neoplasia maligna cerebrale primitiva più frequente; (da solo costituisce il 54% dei gliomi) e la più aggressiva. Si manifesta tipicamente intorno alla VI decade e si localizza prevalentemente agli emisferi cerebrali; è un tumore raro, con una incidenza di circa 3-4 nuovi casi per 100.000 abitanti, per anno. È una neoplasia gravata da un altissimo tasso di mortalità: meno della metà dei pazienti infatti è vivo entro il primo anno e solo il 3% entro i 3 anni.<br>Lo standard terapeutico attuale prevede la resezione chirurgica, quando possibile, seguita da radio e chemioterapia adiuvante; tale regime terapeutico ha incrementato la sopravvivenza da 12,1 mesi a 14,6 mesi con una sopravvivenza globale a 2 anni del 26%, tuttavia le caratteristiche biologiche di questo di tumore, quali la rapidità di crescita e d’invasione dei tessuti circostanti, non consentono di ottenere risultati soddisfacenti.<br> Uno studio accurato dei meccanismi molecolari che sono alla base dei processi di progressione del glioblastoma, potrebbe fornire importanti informazioni sulla sua biologia, da poter utilizzare per scopi prognostici e terapeutici. Tuttavia nel caso del glioblastoma, è molto difficile fare studi di questo genere, essenzialmente per la difficoltà di reperire quantità rappresentative di tessuto tumorale, sia per la sua rarità, sia perché non è sempre resecabile potendo, nella maggior parte dei casi, disporre solo di piccoli frammenti bioptici, con scarsa componente tumorale.<br><br> L’obiettivo del presente studio è stato quello di ottenere nuove e più accurate informazioni sul comportamento biologico del glioblastoma, attraverso l’identificazione di alterazioni molecolari e genetiche, nel tentativo di capire come queste possano, in qualche modo, influenzare la risposta alla terapia, la prognosi, il tempo della prima recidiva e la sopravvivenza globale. Per fare ciò ci siamo avvalsi delle più moderne tecnologie di sequenziamento, quali le metodiche di Next Genaration Sequencing (NGS), in grado di processare un numero elevato di molecole di DNA o RNA in una singola reazione, mantenendo i tempi e i costi contenuti. Le potenziali applicazioni di queste nuove metodiche sono enormi e, tra tutte, lo studio dell’intero trascrittoma umano e dell’esoma, rappresentano sicuramente le applicazioni più importanti. La metodica utilizzata è stata il sistema Ion Proton della Life Technologies, disponibile presso il laboratorio di geno-proteomica della “Fondazione Pisana per la Scienza”.<br><br> Per lo studio sono stati selezionati dall’archivio dell’U.O. di Anatomia Patologica I Universitaria (AOUP), 12 campioni tumorali di glioblastoma umani.<br>Tutti i casi avevano una diagnosi di glioblastoma (grado IV WHO) senza precedenti storici di lesioni a minor grado.<br>I campioni sono stati scelti in modo da ottenere 3 gruppi con una sostanziale differenza nel tempo della prima recidiva dopo la chirurgia: <br>- 6 con recidiva inferiore o uguale a 5 mesi (Short RFS) ;<br>- 3 con tempo di recidiva compreso tra 16 e 23 mesi (Medium RFS);<br>- 3 con tempo recidiva maggiore o uguale a 25 mesi (Long RFS).<br><br>Tutti i 12 campioni sono stati caratterizzati dettagliatamente dal punto di vista molecolare; <br>Inizialmente è stata caratterizzata la presenza delle alterazioni molecolari più frequenti nel glioblastoma: <br>- mutazione R132H nel gene IDH1;<br>- metilazione del promotore del gene MGMT; <br>- amplificazione del gene EGFR e presenza della sua forma tronca (variante III).<br><br>Successivamente, al fine di individuare profili di espressione genica e/o trascritti di fusione, è stato sequenziato con il sistema Ion Proton System (Ion Torren, Life Technologies) l’intero trascrittoma dei campioni selezionati. <br>Nonostante la tipologia del materiale (fissazione in formalina ed inclusione in paraffina), è stato possibile ottenere, con questa nuova metodica, un’ottima performance di reazione.<br><br>Il presente studio ha consentito finora:<br>- di identificare diversi marcatori molecolari, correlati con il tempo della prima recidiva ed in grado di fungere da fattore predittivo. Sono state evidenziate differenze di espressione statisticamente significative in 83 geni, diversamente distribuiti nei 3 gruppi;<br>- è stato inoltre possibile identificare gli specifici processi biologici e le vie genetico-molecolari nei quali sono coinvolti i geni identificati. Un dato molto importante da mettere in evidenza è come il maggior numero di geni differentemente espressi si trovi nei due gruppi agli estremi, ossia tra il gruppo Long RFS e il gruppo Short RFS; tali geni sono coinvolti in molteplici meccanismi cellulari, ma in tutti risalta il ruolo dei miRNA;<br>- di identificare, per la prima volta in letteratura, nuovi trascritti di fusione genica anche questi distribuiti in maniera differente tra i vari gruppi;<br>- di porre le basi per una nuova classificazione molecolare del glioblastoma, che correla con la prognosi e potrebbe consentire una personalizzazione della terapia, così come accade per i carcinomi mammari. <br><br>Le prospettive future del presente studio sono:<br>- validare i biomarcatori molecolari, in particolare i trascritti di fusione, identificati con le tecniche di NGS, mediante ulteriori metodiche di sequenziamento (realt-time PCR e Sequenziamento di Sanger in atto presso i laboratori di geno-proteomica della “Fondazione Pisana per la Scienza”);<br>- aumentare la numerosità del campione; nonostante le difficoltà sopradette, tale limite potrà essere superato proprio grazie a queste nuove metodiche di sequenziamento che permettono di utilizzare materiale di routine o d’archivio, ampiamente a disposizione dei patologi;<br>- creare delle linee cellulari che esprimano in maniera selettiva i geni individuati, in modo da poter essere utilizzate come modelli per saggiare in vitro la chemiosensibilità agli attuali trattamenti o testarne di nuovi;<br>- identificare le eventuali proteine tradotte dai trascritti di fusione, per comprenderne il ruolo nel processo neoplastico, ed eventualmente utilizzarle come target terapeutico;<br>- identificare e validare tali biomarcatori da applicare in test diagnostici molecolari con valore prognostico e predittivo.<br>
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