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Tesi etd-01312013-171939


Thesis type
Tesi di laurea specialistica LC5
Author
BOTTARI, FILIPPO
URN
etd-01312013-171939
Title
Un nuovo metodo di screening in tube di inibitori dell'interazione p53-MDM2
Struttura
FARMACIA
Corso di studi
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Commissione
relatore Prof.ssa Martini, Claudia
relatore Dott.ssa Da Pozzo, Eleonora
Parole chiave
  • p53
  • MDM2
Data inizio appello
06/03/2013;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
06/03/2053
Riassunto analitico
Le neoplasie sono la seconda causa di morte nella popolazione mondiale ogni anno dopo le malattie cardiovascolari. La ricerca di nuovi farmaci in grado di uccidere le cellule cancerose è un tema di grande interesse e in continua evoluzione, in considerazione del fatto che le attuali terapie spesso non risultano sufficienti ad eradicare la patologia. La crescita incontrollata della massa tumorale è dovuta alla capacità delle cellule mailigne di sfuggire ai normali meccanismi regolatori intracellulari, che portano la cellula a morte in condizioni di stress elevato o danni genotossici. p53 è una proteina che si colloca al centro di qusto complesso meccanismo di regolazione vita/morte e la sua attivazione in risposta a diversi fattori stressogeni porta a blocco del ciclo cellulare e induzione di apoptosi. Mutazioni genetiche a carico del gene codificante per p53 si riscontrano nel 50% delle neoplasie e la trascrizione di una proteina non funzionale porta all&#39;immortalizzazione cellulare. Nel restante 50% dei casi, spesso assume un ruolo determinante una proteina responsabile del controllo dei livelli intracellulari di p53, denominata MDM2 (murine double minute 2). MDM2 è capace di legarsi a p53 e di inibirla con differenti modalità. La patologica sovraespressione di MDM2, che non consente a p53 di esercitare le sue normali funzioni, è stata riscontrata in molte neoplasie. È stata inoltre descritta l&#39;ipotesi che MDM2 possa avere anche un ruolo diretto nella formazione dei tumori. In quest&#39;ottica risulta molto interessante lo sviluppo di piccole molecole inibitrici dell&#39;interazione MDM2-p53. In letteratura sono stati descritti diversi approcci sperimentali atti a quantificare l&#39;attività di composti nell&#39;inibire questa interazione. Tali valutazioni si basano su diverse tecniche tra cui saggi immunoenzimatici, risonanza magnetica nucleare, risonanza plasmonica di superficie e fluorescenza polarizzata. Nella maggior parte dei casi queste metodiche non risultano idonee per lo screening di un numero elevato di composti a causa dei costi elevati dei reagenti e della necessità di disporre di grandi quantità di proteine ricombinanti purificate.<br>Nel presente lavoro di tesi sono state eseguite le fasi di progettazione e realizzazione di un nuovo metodo di dosaggio atto ad effettuare un rapido screening di molecole inibitrici dell&#39;interazione MDM2-p53. La metodica proposta si basa sull&#39;utilizzo di lisati batterici contenenti le proteine ricombinanti Glutatione S-transferasi (GST) e Glutatione S-transferasi coniugata con HDM2 (GST-HDM2, dove HDM2 corrisponde ai primi 118 amminoacidi della proteina omologa umana di MDM2). Ai lisati batterici solubili (SBL), diluiti in tampone PBS addizionato di detergente Tween, è stato aggiunto il peptide corrispondente a p53 wild tipe coniugato con biotina (p53-p). In seguito ad incubazione, durante la quale si ha il legame tra p53-p e GST-HDM2, è stata aggiunta streptavidina coniugata con perossidasi di rafano (HRP). Grazie all&#39;alta affinità nei confronti della biotina, la streptatvidina si lega selettivamente al complesso GST-HDM2-p53-p. Il buffer di reazione è stato poi trasferito in piastre rivestite con glutatione, che è il substrato naturale di GST, permettendo l&#39;ancoraggio del complesso GST-HDM2-p53-p sul fondo dei pozzetti. Sono stati effettuati quindi lavaggi con tampone al fine di eliminare l&#39;eccesso di streptavidina e i componenti non complessati ed è stato quindi aggiunto il substrato della perossidasi, la 3,3&#39;,5,5&#39;-tetrametilbenzidina (TMB). In seguito ad acidificazione con acido solforico si è osservato lo sviluppo di una colorazione gialla dovuta alla formazione di diimmina, prodotto di ossidazione del TMB. La lettura spettrofotometrica dell&#39;assorbanza a 450 nm ha permesso di quantificare il legame p53-MDM2. Per verificare la validità del metodo realizzato sono stati utilizzati due composti noti in letteratura legarsi a MDM2 impedendo la sua interazione con p53, Nutlina-3 e ISA27. Tali composti sono stati incubati nel buffer di reazione prima dell&#39;aggiunta del peptide coniugato p53-p e il metodo proposto ha fornito risultati comparabili a quelli riportati in letteratura.<br>I vantaggi del saggio descritto risiedono nel fatto che non richiede l&#39;utilizzo di anticorpi e permette di utilizzare direttamente i lisati batterici senza necessità di purificare le proteine ricombinanti richieste. Risulta quindi indicato per testare un numero elevato di composti in tempi relativamente brevi, con costi contenuti ed elevata specificità.<br>
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