• MDM2
• p53

Le neoplasie sono la seconda causa di morte nella popolazione mondiale ogni anno dopo le malattie cardiovascolari. La ricerca di nuovi farmaci in grado di uccidere le cellule cancerose è un tema di grande interesse e in continua evoluzione, in considerazione del fatto che le attuali terapie spesso non risultano sufficienti ad eradicare la patologia. La crescita incontrollata della massa tumorale è dovuta alla capacità delle cellule mailigne di sfuggire ai normali meccanismi regolatori intracellulari, che portano la cellula a morte in condizioni di stress elevato o danni genotossici. p53 è una proteina che si colloca al centro di qusto complesso meccanismo di regolazione vita/morte e la sua attivazione in risposta a diversi fattori stressogeni porta a blocco del ciclo cellulare e induzione di apoptosi. Mutazioni genetiche a carico del gene codificante per p53 si riscontrano nel 50% delle neoplasie e la trascrizione di una proteina non funzionale porta all'immortalizzazione cellulare. Nel restante 50% dei casi, spesso assume un ruolo determinante una proteina responsabile del controllo dei livelli intracellulari di p53, denominata MDM2 (murine double minute 2). MDM2 è capace di legarsi a p53 e di inibirla con differenti modalità. La patologica sovraespressione di MDM2, che non consente a p53 di esercitare le sue normali funzioni, è stata riscontrata in molte neoplasie. È stata inoltre descritta l'ipotesi che MDM2 possa avere anche un ruolo diretto nella formazione dei tumori. In quest'ottica risulta molto interessante lo sviluppo di piccole molecole inibitrici dell'interazione MDM2-p53. In letteratura sono stati descritti diversi approcci sperimentali atti a quantificare l'attività di composti nell'inibire questa interazione. Tali valutazioni si basano su diverse tecniche tra cui saggi immunoenzimatici, risonanza magnetica nucleare, risonanza plasmonica di superficie e fluorescenza polarizzata. Nella maggior parte dei casi queste metodiche non risultano idonee per lo screening di un numero elevato di composti a causa dei costi elevati dei reagenti e della necessità di disporre di grandi quantità di proteine ricombinanti purificate.
Nel presente lavoro di tesi sono state eseguite le fasi di progettazione e realizzazione di un nuovo metodo di dosaggio atto ad effettuare un rapido screening di molecole inibitrici dell'interazione MDM2-p53. La metodica proposta si basa sull'utilizzo di lisati batterici contenenti le proteine ricombinanti Glutatione S-transferasi (GST) e Glutatione S-transferasi coniugata con HDM2 (GST-HDM2, dove HDM2 corrisponde ai primi 118 amminoacidi della proteina omologa umana di MDM2). Ai lisati batterici solubili (SBL), diluiti in tampone PBS addizionato di detergente Tween, è stato aggiunto il peptide corrispondente a p53 wild tipe coniugato con biotina (p53-p). In seguito ad incubazione, durante la quale si ha il legame tra p53-p e GST-HDM2, è stata aggiunta streptavidina coniugata con perossidasi di rafano (HRP). Grazie all'alta affinità nei confronti della biotina, la streptatvidina si lega selettivamente al complesso GST-HDM2-p53-p. Il buffer di reazione è stato poi trasferito in piastre rivestite con glutatione, che è il substrato naturale di GST, permettendo l'ancoraggio del complesso GST-HDM2-p53-p sul fondo dei pozzetti. Sono stati effettuati quindi lavaggi con tampone al fine di eliminare l'eccesso di streptavidina e i componenti non complessati ed è stato quindi aggiunto il substrato della perossidasi, la 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB). In seguito ad acidificazione con acido solforico si è osservato lo sviluppo di una colorazione gialla dovuta alla formazione di diimmina, prodotto di ossidazione del TMB. La lettura spettrofotometrica dell'assorbanza a 450 nm ha permesso di quantificare il legame p53-MDM2. Per verificare la validità del metodo realizzato sono stati utilizzati due composti noti in letteratura legarsi a MDM2 impedendo la sua interazione con p53, Nutlina-3 e ISA27. Tali composti sono stati incubati nel buffer di reazione prima dell'aggiunta del peptide coniugato p53-p e il metodo proposto ha fornito risultati comparabili a quelli riportati in letteratura.
I vantaggi del saggio descritto risiedono nel fatto che non richiede l'utilizzo di anticorpi e permette di utilizzare direttamente i lisati batterici senza necessità di purificare le proteine ricombinanti richieste. Risulta quindi indicato per testare un numero elevato di composti in tempi relativamente brevi, con costi contenuti ed elevata specificità.