• PCO4
• Arabidopsis thaliana
• ipossia
• ossigeno
• Cys-N-degron pathway
• biologia sintetica
• Saccharomyces cerevisiae

L’ossigeno è essenziale per il metabolismo energetico nella maggior parte degli eucarioti. In piante, l’ossigeno è percepito mediante la via proteolitica “Cys-Arg/N-degron” (Cys-NDP), responsabile di modifiche post-traduzionali che controllano la stabilità di specifiche proteine. In Arabidopsis thaliana, i target di questo pathway sinora identificati, rispetto alle proteine candidate ad esserlo, sono ancora molto pochi e la scoperta di nuovi substrati può essere un grande potenziale per migliorare le prestazioni agronomiche. Pertanto, l’obiettivo di questa tesi è stato valutare se alcune proteine di pianta potessero essere substrati della via Cys-NDP usando il sistema eterologo lievito e nel validare in pianta i risultati ottenuti da questo sistema.
Sono stati testati 14 possibili substrati della via Cys-NDP. Sono stati generati vettori di espressione, contenenti le sequenze codificanti per i singoli substrati fuse al reporter luciferasi di lucciola, mediante la tecnologia Gateway. Questi sono stati usati per trasformare lievito e pianta, trattati in condizioni normossiche (21% O2 v/v, 6 h) e ipossiche (1% O2 v/v, 6 h) e la stabilità dei substrati è stata dedotta dall’attività del reporter. Le analisi statistiche sono state condotte usando il t-test di Student non accoppiato a due code. Sono stati inoltre preparati ulteriori costrutti proteina-reporter e promotore-reporter per la susseguente valutazione in pianta della regolazione del migliore dei substrati.
Il saggio eterologo ha mostrato che 4 dei 14 substrati testati mostrano complessivamente stabilità dipendente dall’ossigeno. Questi sono stati valutati in A. thaliana, mediante trasformazione transiente di tessuti fogliari con i medesimi costrutti di fusione in idonei vettori d’espressione. I saggi in pianta hanno confermato la dipendenza da Cys-NDP per tre dei substrati. Il più promettente di essi è una proteina coinvolta nella morfogenesi fogliare e potrebbe rivelarsi collegata ai fenotipi delle piante associate ad un Cys-NDP difettoso. I profili di espressione e le funzioni di tale fattore nella fisiologia della pianta saranno ulteriormente studiati in futuro.