• protein secretion
• flhF
• flagella-mediated motility.
• Bacillus cereus
• SRP

Bacillus cereus è un bastoncello Gram positivo, sporigeno e mobile grazie alla presenza di flagelli peritrichi. Da lungo tempo noto come contaminante degli alimenti e patogeno alimentare, Bacillus cereus viene sempre più frequentemente riconosciuto anche come agente responsabile di infezioni locali e sistemiche nell’uomo. Il potenziale patogenetico del microrganismo è dovuto alla secrezione di una varietà di enzimi e fattori di virulenza, che comprendono emolisine, fosfolipasi, proteasi, citotossine e complessi enterotossici, ma anche a fattori di motilità flagello-dipendenti (swimming e swarming) che possono favorire l’adesione e la diffusione nei tessuti dell’ospite. In particolare, la motilità swarming, migrazione collettiva delle cellule su una superficie solida che prevede la differenziazione di cellule planctoniche in cellule swarm, è stata associata ad un aumento della virulenza di B. cereus in modelli animali.
In uno studio precedente effettuato dal laboratorio in cui è stato svolto il presente lavoro di tesi, è stato dimostrato che la proteina FlhF di B. cereus è necessaria per la corretta produzione di flagelli e per la secrezione di alcuni fattori virulenza. Il gene flhF, identificato anche in altri microrganismi flagellati, codifica per una proteina citoplasmatica che mostra omologia strutturale con la famiglia delle signal recognition particle (SRP), responsabili del trasporto alla membrana plasmatica di proteine che debbono essere esportate all’esterno della cellula o essere collocate all’interno della membrana stessa. Un mutante di B. cereus (ΔflhF o MP06) portante una delezione in flhF mostrava un alterato profilo di secrezione di alcune tossine batteriche ed, in particolare, una riduzione della componente L2 dell’emolisina BL (HBL-L2) e della citotossina K (CytK), ma anche un’alterazione del numero e della localizzazione dei flagelli sulla superficie cellulare ed una riduzione nella quantità di flagellina extracellulare.
Il presente lavoro di tesi si è posto l’obiettivo di comprendere se FlhF potesse svolgere il ruolo di SRP in B. cereus e se tale proteina potesse essere coinvolta in funzioni cellulari dipendenti dal targeting di proteine alla membrana, tra cui motilità swimming, differenziamento swarming e secrezione di fattori di virulenza.
In una prima parte del lavoro, è stato valutato l’effetto della deplezione di FlhF portata dal ceppo ΔflhF sulla motilità swimming in terreno semisolido e sul differenziamento e la migrazione swarming su una superficie solida di crescita. I risultati hanno evidenziato che il ceppo ΔflhF presenta una marcata riduzione della motilità swimming ed una completa incapacità sia di migrare su superfici solide che di produrre cellule swarm differenziate.
Per comprendere meglio i meccanismi molecolari con cui FlhF può regolare, direttamente o indirettamente, la produzione di flagelli e la secrezione di fattori di virulenza, sono stati effettuati esperimenti d’interazione proteina-proteina mediante l’impiego del Bacterial Two Hybrid System (BACTH). A questo scopo, sono stati allestiti numerosi costrutti portanti i geni flhf, hblC (codificante la componente L2 dell’emolisina BL), cytK (codificante la citotossina K) e flaC (codificante la flagellina) fusi in frame con in frammenti T18 e T25 di un sistema reporter basato sull’attività dell’adenilato ciclasi. Gli esperimenti di spot assay effettuati per valutare l’interazione fisica diretta tra FlhF e le suddette proteine e, quindi, avvalorare il ruolo di FlhF come SRP hanno dimostrato che questa interagisce fisicamente con CytK e HBL-L2 mentre, secondo questo modello teorico FlhF non sembra interagire con la flagellina BC1657.
Per verificare che il difetto di secrezione dei fattori di virulenza CytK e HBL-L2 e della flagellina BC1657, da parte del ceppo ΔflhF, non fosse dovuto ad una concomitante riduzione dei livelli di espressione dei geni codificanti queste proteine, è stato effettuato un confronto dei livelli di espressione dei geni stessi, tra il ceppo parentale e il ceppo mutante, mediante studi di Real Time PCR quantitativa.
Dai risultati è emerso come la mancanza di FlhF nel ceppo MP06 comportasse una riduzione dei livelli di espressione di bc1657 e di cytK, mentre non influiva in alcun modo sull’espressione di hblC.
Considerando i dati ottenuti dal saggio di interazione e dagli studi di Real Time PCR, si può affermare che la riduzione dei livelli di espressione della proteina BC1657 nel secretoma del ceppo MP06, può essere giustificata completamente dalla riduzione dei livelli di espressione del gene bc1657 nello stesso ceppo. Questa è probabilmente dovuta ad un effetto di feedback negativo sull’espressione della flagellina causato dal ridotto numero di flagelli assemblati sulla superficie del ceppo mutante ΔflhF.
La diminuita secrezione di CytK sembra essere dovuta alla duplice azione di FlhF, sia nella regolazione dei suoi livelli di espressione, che nel suo trasporto verso i sistemi di secrezione, in particolare verso il Sec traslocase, per cui CytK possiede il peptide segnale.
Infine la proteina HBL-L2, mostra dei livelli di espressione nel mutante ΔflhF, comparabili a quelli nel ceppo parentale e una interazione fisica con FlhF secondo il modello in vivo utilizzato. Si può ipotizzare che la riduzione della secrezione della componente L2 possa essere imputata alla deplezione di FlhF e alla sua mancata azione come proteina SRP-like, indirizzando L2 verso i sistemi di secrezione, tra cui probabilmente il sistema di secrezione flagellare.
In conclusione, nella presente tesi è stato valutato che FlhF ha un ruolo nella capacità di Bacillus cereus di muoversi, sia in ambiente liquido sia sulle superfici solide, inoltre sembra essere implicata nel trasporto dei fattori di virulenza CytK e HBL-L2 verso i sistemi di secrezione specifici.