• CACCC-DELTA-LCR
• GENE DELTA GLOBINICO
• Th3/+

Attivazione del gene Delta globinico umano in vivo

La beta talassemia è una malattia genetica del sangue causata da mutazioni a carico del gene Beta globinico, che portano a una riduzione o a una mancata produzione dell’emoglobina adulta o emoglobina A.
L’emoglobina A, costituita da due catene Alfa globiniche e due catene Beta globiniche (α2β2), rappresenta l’emoglobina più abbondante nell’adulto (95%). Nel soggetto adulto sono ancora presenti l’emoglobina fetale (α2γ2) (2%) e l’emoglobina A2 (α2δ2), quest’ultima rappresenta il 2-3% dell’emoglobina totale.
Il gene Delta globinico è altamente omologo del gene Beta. I livelli di espressione del primo sono più bassi rispetto al secondo. Confrontando le sequenze promoter dei due geni si nota l’assenza del sito di legame per il fattore di trascrizione EKLF (CACCC) nel promoter Delta.
Dai risultati preliminari si è visto che inserendo la sequenza CACCC si ottiene una sostanziale attivazione del promoter Delta.
L’obiettivo della tesi è di studiare se e fino a che punto sia possibile attivare il gene δ globinico in vivo e di validarlo come possibile target terapeutico per la beta talassemia attraverso la produzione di topi transgenici.
È stato disegnato un costrutto contenente: la microLCR, il δ promoter mutagenizzato con il CACCC e il gene Delta globinico umano (il topo non possiede il gene δ). Questo costrutto è stato microiniettato in ovociti fertilizzati, successivamente impiantati nell’ovidotto di femmina pseudogravida per l’ottenimento di una linea transgenica CACCC δ LCR.
I primi risultati mostrano che la linea è a singola copia e si osserva inoltre un discreto aumento dei livelli di espressione del gene δ (30 % rispetto al gene Beta).
I topi della linea transgenica sono stati fatti incrociare con una linea knock-out per i geni beta (Hbb-Th3). I Th3 sono un modello murino per la talassemia β, caratterizzato dalla delezione di entrambi i geni codificanti per la catena β presenti nel cluster globinico del topo. I topi eterozigoti per la delezione mostrano i sintomi caratteristici di una talassemia intermedia quali: anemia, eritropoiesi inefficace, splenomegalia e accumulo di ferro negli organi (fegato, milza e reni). I topi omozigoti muoiono perinatalmente.
I nati dall’incrocio delle due linee sono stati screenati attraverso PCR per verificare la presenza di entrambi i transgeni. Su tutti gli animali sono stati analizzati i livelli di emoglobina ed altri parametri del sangue. Nei soggetti positivi per entrambi i transgeni ( TH3/+,CACCC δ LCR/+ Hb 10,5 g/dL ± 1,3 ; TH3/+,CACCC δ LCR/ CACCC δ LCR Hb 11,6 g/dL ± 0,94) si è visto un miglioramento nel fenotipo talassemico rispetto ai topi TH3/+(Hb 8,7 g/dL ± 1,2).