• metabolismo
• carcinoma polmonare
• 5'-Nucleotidasi citosolica
• nucleotidi

La 5’ nucleotidasi citosolica (cN-II) è un enzima bifunzionale ubiquitario appartenente alla superfamiglia delle dealogenasi aloacide (HAD), che catalizza sia la reazione di idrolisi del fosfato in 5’ dell’IMP e del GMP, sia la reazione di trasferimento di un gruppo fosfato da un nucleoside monofosfato donatore verso un nucleoside accettore. Queste attività sono regolate positivamente da un gran numero di molecole, quali ADP, ATP, 2,3-bisfosfoglicerato (BPG) e sono inibite dal fosfato. Il ruolo fisiologico dell’enzima è mantenere l’omeostasi dei nucleotidi, in particolare dell’IMP e dei suoi derivati ed è per questo che risulta particolarmente espressa in tutte le cellule aventi un rapido turnover di acidi nucleici, come le cellule della mucosa intestinale, così come nelle cellule tumorali.
L’enzima è stato purificato da numerose fonti e studiato per poterne caratterizzare la struttura, la regolazione ed i parametri cinetici. E’ stato dimostrato che la cN-II è responsabile della fosforilazione di alcuni analoghi dei nucleosidi utilizzati nella terapie antivirali e antitumorali, e il suo livello di espressione è determinate per il successo o meno della chemioterapia in alcuni tipi di leucemie.E' inoltre considerato un marker di malignità.
Il migliore approccio per comprendere l’importanza di tale enzima sia in condizioni patologiche che fisiologiche consiste nella messa a punto di modelli cellulari in cui l’espressione di tale enzima sia modificata. Il silenziamento transitorio dell’enzima in cellule di astrocitoma umano (ADF) tramite la sintesi di un siRNA in seguito a trasfezione con un vettore virale, causa una diminuzione significativa della vitalità delle cellule, e attivazione del pathway apoptotico. Il principale effetto del silenziamento costitutivo, ottenuto nelle A549, sembra essere invece uno shift metabolico da un fenotipo più glicolitico ad un fenotipo più ossidativo e con maggiori difese antiossidanti, accompagnato da un rallentamento della crescita.
Nella mia tesi ho utilizzato cellule di carcinoma polmonare NCI-H292 in cui la cN-II è stata stabilmente silenziata con due tecniche differenti. In una linea cellulare (pScN-II), grazie all’impiego di un plasmide in cui è stata inserita una sequenza codificante per uno shRNA target per la cN-II, si è ottenuto un silenziamento costitutivo parziale. In una seconda linea cellulare, le NCI-H292 cN-II -/-, la cN-II è stata silenziata grazie con l’impiego della tecnica Crispr-Cas9. Per entrambi i trattamenti, avevamo a disposizione l’opportuna linea cellulare di controllo: le cellule pScont, trasfettate con un plasmide non-targeting di controllo e le cellule NCI-H292 cN-II +/+ in cui è stato inserito un plasmide mancante dell’RNA guida.
L’obbiettivo di questa tesi è descrivere gli effetti diretti o indiretti del silenziamento parziale della cN-II in un nuovo modello di carcinoma polmonare, nell’ottica di confermare i risultati precedentemente ottenuti sulle A549. Inoltre, avendo a disposizione cellule in cui l’attività della cN-II veniva abolita, abbiamo raccolto informazioni su gli effetti, ancora poco conosciuti, derivanti da un silenziamento totale.
Nelle cellule così trattate, sono andata a valutare la concentrazione di glutatione ridotto, come indice delle difese antiossidanti, l’ attività mitocondriale misurata in termini di attività della citrato sintasi, velocità della glicolisi misurata come attività della esochinasi e della lattico deidrogenasi, velocità di produzione del lattato ed infine la presenza negli estratti cellulari di marker molecolari quali P53, AKT, AMPK (sia totali che fosforilati).
In conclusione ci aspettiamo di poter ottenere un quadro completo delle alterazioni causate sia dal silenziamento parziale che totale della 5’ nucleotidasi citosolica cN-2, per quanto riguarda il metabolismo glucidico, nucleotidico e la capacità proliferativa di cellule di carcinoma polmonare umano NCI-H292.