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Tesi etd-01242008-152405


Thesis type
Tesi di laurea vecchio ordinamento
Author
MACRI', SIMONE
URN
etd-01242008-152405
Title
Studio dell’espressione e della funzione del gene hmgax in Xenopus laevis
Struttura
SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
Corso di studi
SCIENZE BIOLOGICHE
Commissione
Relatore Prof. Vignali, Robert
Parole chiave
  • hmgax
  • xenopus
  • espressione
  • funzione
Data inizio appello
25/02/2008;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
25/02/2048
Riassunto analitico
I geni hmg fanno parte di una superfamiglia di fattori nucleari non istonici coinvolti nel rimodellamento della cromatina. Sono presenti in tutti i metazoi, piante e lieviti.<br>L’acronimo che li identifica sta per “High Mobility Group” e mette in risalto le ridotte dimensioni (&lt;30kDa) e l’elevata mobilità elettroforetica in gel di poliacrilammide delle proteine da essi codificate.<br>Nei mammiferi sono presenti tre classi di proteine HMG: HMGA, HMGB e HMGN.<br>Le proteine HMGA sono classificate in tre gruppi: HMGA1a, HMGA1b (derivanti dallo splicing alternativo dello stesso gene) e HMGA2. Sono tutte caratterizzate dalla capacità di legare il DNA grazie a domini molto conservati composti da 11 amminoacidi, chiamati “AT-hooks”, che contraggono rapporti con regioni ricche in adenina-timina nel solco minore della doppia elica dell’acido nucleico. Inoltre, esse presentano domini di interazione proteina-proteina e numerosi siti suscettibili a modificazioni post-traduzionali. Queste proprietà rendono le proteine HMGA dei componenti molto importanti nei complessi nucleoproteici che si organizzano durante fenomeni che comportano il riarrangiamento di ampie porzioni della cromatina quali la trascrizione, l’integrazione virale e l’induzione della trasformazione neoplastica. <br>Nel topo i geni Hmga1 e Hmga2 si trovano prevalentemente espressi durante lo sviluppo embrionale, con un picco che va da 8.5 dpc (days post coitum) a 16.5 dpc, per poi calare drasticamente con l’inizio dell’organogenesi e scomparire quasi del tutto nei tessuti adulti. Un’eccezione sembra essere la recente osservazione della presenza, in elevata quantità, di HMGA1 nei fotorecettori retinici di topi adulti. In particolare, è stata dimostrata l’interazione di HMGA1 con il fattore di trascrizione CRX, volta a promuovere la trascrizione del gene codificante per la rodopsina.<br>Nel nostro laboratorio di recente è stato clonato e analizzato il pattern d’espressione spazio-temporale del gene hmga2 nello Xenopus laevis, confermandone l’omologia con il corrispettivo murino.<br>Partendo da questo risultato, attraverso l’utilizzo di sistemi di ricerca di omologie in banche dati genomiche, è stata ottenuta la sequenza di un putativo gene della famiglia hmga che, in attesa di evidenze sperimentali in grado di chiarirne la natura, abbiamo denominato Xlhmgax. Sulla base di questa sequenza, abbiamo disegnato degli oligonucleotidi specifici e il gene è stato clonato mediante RT-PCR in diversi vettori plasmidici.<br>L’analisi dell’andamento dell’espressione del gene è stata condotta mediante RT-PCR semi-quantitava. I risultati hanno rivelato un’espressione che inizia negli stadi precoci dello sviluppo a livelli consistenti, per poi decrescere linearmente fino a non essere quasi riscontrabile a stadio 42 (larva natante). Inoltre, è stata indagata l’espressione del gene in organi adulti come occhio e cervello nei quali, seppur in misura molto ridotta, essa è stata riscontrata.<br>Abbiamo quindi realizzato una serie di esperimenti di ibridazione in situ su embrioni interi (whole mount) per analizzare l’espressione spaziale del gene durante lo sviluppo embrionale. A tale scopo abbiamo utilizzato embrioni di Xenopus a diversi stadi di sviluppo, partendo dallo stadio di 2 blastomeri fino a stadi più avanzati dell’embriogenesi e in particolare fino a stadio 42. Dall’analisi della marcatura è stato possibile individuare le regioni e gli stadi in cui il gene è maggiormente espresso. Territori preferenziali sembrano essere le porzioni anteriori del Sistema Nervoso Centrale (SNC) e in particolare, come messo in evidenza dalle sezioni ricavate al microtomo dopo inclusione degli embrioni in paraffina, il tubo neurale e la zona del margine ciliare (CMZ) della retina.<br>Sulla base dei risultati ottenuti nel topo, in cui è stata ampiamente dimostrata l’interazione delle proteine HMG con fattori di trascrizione con omeodominio, abbiamo effettuato saggi di interazione diretta proteina-proteina mediante GST-pulldown tra XlHMGAX e XOTX2/XOTX5b (omologo di CRX), che rivestono un ruolo importante nello sviluppo del SNC e dell’occhio in Xenopus. Tuttavia, i risultati hanno dimostrato l’assenza di associazione in vitro tra queste proteine e XlHMGAX.<br>Allo scopo di caratterizzare il ruolo funzionale del gene in esame è stata condotta, in vivo, un’analisi preliminare di perdita della funzione attraverso esperimenti di microiniezione di oligonucleotidi Morpholino antisenso, appositamente disegnati contro la sequenza di Xlhmgax. L’efficacia e la specificità d’azione del Morpholino sono state dimostrate mediante l’utilizzo di due costrutti sensori, da noi generati, contenenti la sequenza target del Morpholino a monte della regione codificante per la GFP (Green Fluorescent Protein). <br>I risultati ottenuti dopo diversi cicli di microiniezioni, condotte in embrioni allo stadio di quattro blastomeri, mostrano come l’abbattimento dell’espressione del gene Xlhmgax provochi aberrazioni sostanziali nella formazione delle strutture anteriori e dorsali degli embrioni, con particolare incidenza nel corretto sviluppo dell’occhio. Per chiarire le cause molecolari di questi effetti macroscopici sono attualmente in corso saggi con marcatori della proliferazione delle regioni anteriori della piastra neurale ed in particolare del campo morfogenetico dell’occhio.
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