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• microcephaly
• neuronal connection impairment
• SETD5
• synapses
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I disturbi dello spettro autistico (ASD) sono un insieme di gravi disordini dello sviluppo neurale, spesso conseguenti ad una complessa combinazione di fattori genetici e ambientali. Essi presentano alcune caratteristiche comuni che si manifestano sin dalla prima infanzia. I sintomi più frequenti comprendono difficoltà comunicative, ridotta o assente interazione sociale e problemi nella gestione della sfera emotiva, oltre ad alterazioni craniofacciali nei casi più gravi.
Recentemente, mutazioni che determinano la perdita di funzione (LoF) del gene SETD5 sono state associate ad un aumento del rischio di ASD e altre disabilità intellettive (ID). SETD5 è altamente espresso nel sistema nervoso e, nell’uomo, mappa sul braccio corto del cromosoma 3, nel segmento che risulta completamente deleto nei pazienti affetti da Sindrome da microdelezione 3p25.3, caratterizzata da ID, microcefalia, dismorfismo facciale e difetti cardiaci. SETD5 codifica per una proteina contenente un dominio SET, che, in un recente studio, è risultato capace di catalizzare la tri-metilazione di residui di lisina H3K36. Ciò indica che SETD5 sia in grado di regolare l’espressione genica agendo sullo stato della cromatina.
Nel presente lavoro di tesi, un modello di zebrafish mutante per setd5, precedentemente generato nel nostro laboratorio mediante la tecnica di gene editing CRISPR/Cas9, è stato utilizzato per caratterizzare il potenziale effetto della perdita di funzione del gene setd5 sullo sviluppo del SNC, focalizzandoci in particolare sullo studio di geni correlati allo sviluppo neurale e alla struttura/funzionalità sinaptica.
Poiché in precedenza era stato dimostrato che il trascritto di setd5 fosse già presente nell’oocita maturo, abbiamo voluto investigare circa il ruolo della componente materna. Per tale motivo, nei vari esperimenti presentati in questo lavoro, ci siamo avvalsi di incroci mirati effettuati fra adulti setd5+/+ e setd5-/-, in modo da poter studiare l’effetto della mutazione sia nell’RNA genomico, sia in quello materno.
L’analisi morfometrica effettuata sugli adulti ha evidenziato come la LoF di setd5 influisce sul rapporto fra la grandezza della testa e il resto del corpo, determinando individui microcefalici. Inoltre, essa determina una significativa riduzione delle dimensioni di importanti aree quali il telencefalo e il tetto ottico. L’analisi dell’espressione tramite RT-qPCR del gene dyrk1aa, un altro gene notoriamente correlato a ID ed ASD, la cui aploinsufficienza nell’uomo causa microcefalia, ha inoltre evidenziato una riduzione dei trascritti nei cervelli di adulti di zebrafish a seguito della perdita di funzione di setd5.
L’analisi dell’espressione di alcuni geni chiave della struttura e funzionalità sinaptica, effettuata sui cervelli di pesci adulti mediante RT-qPCR, ha mostrato che l’inattivazione di setd5 determina una riduzione significativa nell’espressione dei geni sypa, homer1b e shank3a/b. Gli stessi geni sono stati studiati anche nelle larve a 48hpf, rivelando anche qui una riduzione significativa dei livelli di sypa negli eterozigoti col materno mutato, mentre il gene homer1b non mostra differenza significative.
Abbiamo inoltre studiato, in embrioni a 48hpf, eventuali alterazioni di geni coinvolti nel metabolismo dei neurotrasmettitori, th1 per il sistema catecolaminergico, ddc per il sistema catecolaminergico e serotoninergico, gad1a per il sistema GABAergico, serta per il sistema serotoninergico e vmat2 codificante per il trasportatore monoaminico vescicolare. Di questi geni è stata analizzata anche la localizzazione tramite ibridazione in situ whole-mount. Si è visto che solo i geni gad1a e ddc presentano una riduzione significativa dei livelli di trascritto negli individui eterozigoti e setd5-/- sebbene una tendenza simile si osservi per tutti i geni sopraelencati. Per quanto riguarda la regolazione dello sviluppo precoce del sistema nervoso, embrioni a 24hpf sono stati sottoposti ad ibridazione in situ per i marcatori di specificazione neurale otpb, six3a, pax2a ed emx1 al fine di caratterizzarne l’espressione, ma non abbiamo osservato differenze nelle diverse condizioni.
Nel complesso, i nostri dati suggeriscono che la LoF di setd5 potrebbe causare alterazioni nella struttura e nella funzionalità sinaptica (una caratteristica spesso osservata anche in individui affetti da ASD), oltre a determinare un ritardo nello sviluppo del SNC in zebrafish, che si manifesta determinando una condizione microcefalica negli adulti.