• Rifaximina
• suino
• citocromo P450

Il sistema citocromo P450 (CYP) è una superfamiglia genica che svolge un ruolo fisiologico importante nel metabolismo di sostanze endogene ed esogene, costituita da emoproteine appartenenti alla sottoclasse delle ossidasi a funzione mista. Si tratta di enzimi di fase I presenti prevalentemente a livello epatico, ma che generalmente si riscontrano anche in molti tessuti extraepatici. Nei mammiferi, sebbene il fegato presenti il più alto contenuto di CYP, anche il duodeno mostra livelli significativi di CYP giocando un ruolo importante nel metabolismo degli xenobiotici assunti per via orale.
In questo lavoro di tesi è stato scelto il suino come modello sperimentale in quanto è stato proposto, negli ultimi anni, come modello animale per studi di farmacologia e tossicologia a causa delle sue somiglianze anatomiche e fisiologiche con l’uomo, soprattutto a livello del tratto digerente e dell’apparato cardiovascolare, oltre che per le potenziali applicazioni cliniche. Tuttavia, le conoscenze riguardo gli enzimi metabolici del suino sono scarse, sia a livello epatico che a livello extraepatico.
E’ noto, da studi precedenti, che la rifampicina (un antibiotico della classe dei macrolidi) è un agonista di PXR ed è in grado di indurre fortemente nell'uomo, nel ratto e nel suino l’espressione dei CYP2B, 2C e 3A e di alcuni trasportatori tramite l'attivazione del recettore nucleare pregnane X receptor (PXR). La rifaximina, un derivato semisintetico della rifampicina, a differenza di quest’ultima, si ritrova ad alte concentrazioni a livello intestinale e minime a livello del circolo sistemico, quando è somministrata per via orale, nell’uomo.
Lo scopo di questa tesi è stato quello di valutare la capacità modulatoria della rifaximina nel suino a seguito di trattamenti in vivo per via intraperitoneale e per via orale, su una isoforma della sottofamiglia 2B (CYP2B22), tre isoforme della sottofamiglia 2C (CYP2C33, CYP2C42 e CYP2C49) e quattro isoforme della sottofamiglia 3A (CYP3A22, CYP3A29, CYP3A39 e CYP3A46) e tre trasportatori P-gp (MDR1), MRP1 e MRP2 noti per essere regolati principalmente, nell’uomo, dall’attivazione di PXR.
Dal fegato e dal duodeno di tre suini di controllo, tre suini trattati in vivo con rifaximina oralmente e tre suini trattati in vivo con rifaximina per via intraperitoneale è stato estratto e retrotrascritto l'RNA totale. Con il relativo cDNA sono stati eseguiti analisi di RT-PCR qualitativa e real rime RT-PCR.
I risultati ottenuti a livello trascrizionale sono stati successivamente confrontati con quelli ottenuti dai saggi enzimatici effettuati sulle frazioni microsomiali epatiche ed intestinali. Nello specifico abbiamo utilizzato l’attività 7-metossi-4-trifluorometilcumarina-O-demetilasi (MFCOD) marcatrice di isoforme della sottofamiglia CYP2C, condotto su microsomi di fegato e duodeno. Le attività enzimatiche 7-etossi-4-trifluorometilcumarina-O-deetilasi (EFCOD) e 9-antraldeide ossidasi (AnOx) marcatrici di isoforme della sottofamiglia CYP2B, condotti su microsomi di fegato e duodeno. E infine la benzilossichinolina debenzilasi (BQD) e la 6β-idrossilazione del testosterone sia su microsomi di fegato che duodeno, e l’eritromicina demetilasi (ErD) solo sul fegato, per i CYP3A. Infine sono stati eseguiti esperimenti di Western Blotting, che hanno permesso di investigare a livello proteico le isoforme appartenenti alla sottofamiglia 2B, 2C e 3A.
A livello epatico, è stato evidenziato un aumento della trascrizione dei soli CYP2C42 e CYP2C49, a seguito del trattamento con rifaximina per via orale. Il risultato è stato confermato a livello proteico e di attività enzimatica (attività MFCOD). Al contrario, inaspettatamente per i CYP3A epatici è stata osservata una diminuzione dell’espressione e delle attività enzimatiche. Per il CYP2B22 epatico in seguito ai trattamenti con rifaximina nessuna modulazione è stata evidenziata, come accertato con gli esperimenti di RT-PCR ed i saggi di attività enzimatica EFCOD e AnOx. A livello intestinale i trattamenti con rifaximina hanno determinato un’induzione non solo dei CYP2C42 e CYP2C49, ma anche del CYP3A46; in parallelo, le attività MFCOD, BQD e testosterone 6β-idrossilasi effettuate con microsomi intestinali sono risultate significativamente aumentate. Non è stato, invece, riscontrato alcun aumento dell’espressione del CYP2B22 o dell’attività AnOx, o con analisi di Western Blotting.
Per quanto riguarda i trasportatori, è stato evidenziato un aumento statisticamente significativo dell’espressione di MDR1 soltanto nei campioni epatici dei suini trattati con rifaximina per via intraperitoneale, in accordo con i dati presenti in letteratura per la rifampicina, Tuttavia, né MRP1 né MRP2 sono risultati essere modulati dai trattamenti con rifaximina, sebbene nell’uomo siano inducibili da rifampicina.
In conclusione, gli effetti prodotti dalla rifaximina nel suino differiscono da quelli riportati per la rifampicina. La scarsa modulazione ottenuta a seguito del trattamento intraperitoneale potrebbe essere dovuta ad un minimo rilascio della rifaximina dalla miscela oleosa in cui è stata somministrata agli organi addominali. Il maggiore effetto induttivo, seppure limitato, ottenuto per somministrazione orale è forse dovuto ad un parziale assorbimento della rifaximina negli enterociti - dove esercita la sua azione induttiva - ma non nel fegato del suino così come avviene nell’uomo. Inoltre altre ipotesi possono essere avanzate: a) la presenza di fattori di regolazione tessuto-specifici, b) la presenza di differenze nella sequenza amminoacidica del PXR di suino rispetto a quello umano, che potrebbe influenzare il legame dell’agonista al recettore.
Ulteriori studi sono necessari per confermare la capacità della rifaximina di agire da attivatore del PXR di suino.