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Digiuno e plasticità: come le conseguenze del digiuno influenzano la plasticità della corteccia visiva nel topo adulto
Il mio progetto di tesi parte dall’evidenza che lo stato metabolico del nostro organismo possa influire sulle funzioni neurali, influenzando così la fisiologia del cervello, ed infine, i processi cognitivi e il comportamento (Gomez-Pinilla 2008; Mattson, Moehl et al. 2018). L’esistenza di un’interazione tra nutrizione e fisiologia del sistema nervoso centrale (SNC), è stata suggerita dagli effetti che specifiche alterazioni della dieta hanno su alcune malattie neurologiche (Canevelli, Lucchini et al. 2016; Dadhania, Trivedi et al. 2016; Augustin, Khabbush et al. 2018). Già Ippocrate, 2400 anni fa, scriveva che il digiuno può prevenire o rendere meno severi gli attacchi epilettici. Seguendo la stessa linea di pensiero e con un approccio più moderno, l’epilessia refrattaria nei bambini è stata spesso trattata tramite dieta chetogenica(Varlamis, Vavatsi et al. 2013), uno specifico regime dietetico caratterizzato da elevate percentuali di grassi ed una bassissima percentuale di carboidrati, capace di mimare gli effetti metabolici del digiuno. Infatti, sia il digiuno sia la dieta chetogenica, diminuiscono la concentrazione di glucosio e insulina nel sangue, e attraverso l’attivazione di una cascata biochimica chiamata chetogenesi, incrementano la produzione dei corpi chetonici (Walczyk and Wick 2017). La dieta chetogenica sembra avere effetti positivi anche su disturbi neurodegenerativi (ad esempio sindromi di Alzheimer e Parkinson) e del neurosviluppo (e.g. autismo). Infine, la dieta chetogenica, il digiuno a intermittenza e l’assunzione di integratori contenenti corpi chetonici e loro precursori sono spesso usati per migliorare le prestazioni sportive, cognitive e per perdere peso (Evans, Cogan et al. 2017). Nonostante queste evidenze, le basi neurali e i meccanismi attraverso cui lo stato metabolico attivato dal digiuno o i corpi chetonici possano influenzare la funzione neurale sono ancora poco esplorati.
È noto che la dieta chetogenica, il digiuno e l’esercizio fisico prolungato promuovano la deplezione delle riserve epatiche di glicogeno, favorendo la diminuzione del livello di glucosio ematico. Parallelamente, aumentano la produzione di corpi chetonici, di cui quello più abbondante in circolo è il beta-idrossi-butirrato (bOHB) che, assorbito dai tessuti, viene usato come combustibile energetico alternativo e convertito in acetil-CoA per fornire energia. È però importante sottolineare che il bOHB non è solo un combustibile energetico, ma agisce anche da messaggero molecolare interagendo con recettori metabotropici, come HCAR2 e FFAR3, influenzando l’omeostasi dei lipidi e del glucosio, rispettivamente(Newman and Verdin 2017).Inoltre, è implicato nella regolazione epigenetica agendo sia da inibitore degli enzimi istone deacetilasi, modulando quindi l’acetilazione degli istoni (Shimazu, Hirschey et al. 2013), sia come donatore di gruppi chimici per una nuova modifica epigenetica, la beta-idrossibutirrilazione della lisina sugli istoni, la quale è associata ad un incremento dell’espressione genica (Xie, Zhang et al. 2016). I livelli di bOHB sono inoltre in grado di regolare la biosintesi e l’immagazzinamento dei neurotrasmettitori, in particolare il GABA (Ma, Berg et al. 2007); infine, il bOHB è in grado di far aumentare l’espressione del BDNF (Marosi, Kim et al. 2016), fattore neurotrofico noto per varie azioni sulle funzioni e plasticità del SNC, inclusi sviluppo e plasticità del sistema visivo (Huang, Kirkwood et al. 1999; Bartoletti, Cancedda et al. 2002).
Al fine di comprendere gli effetti del digiuno sulla plasticità e funzione del SNC, abbiamo utilizzato un modello classico per lo studio del neuro-sviluppo post-natale, l’elaborazione degli stimoli e la plasticità neuronale: il sistema visivo murino(Seabrook, Burbridge et al. 2017). La visione è probabilmente uno dei processi più studiati sia nel cervello umano sianel cervello roditore. La manipolazione degli stimoli visivi si traduce in conseguenze comportamentali, spesso distinte nei soggetti giovani e adulti(Hubener and Bonhoeffer 2014). Normalmente, gli effetti della deprivazione degli stimoli sensoriali, ottenuti in questo caso tramite deprivazione monoculare (DM, la sutura della palpebra di un occhio), sono altamente evidenti solo durante il periodo critico per la plasticità di dominanza oculare (OD), una specifica finestra temporale dello sviluppo postnatale in cui i circuiti neuronali visivi sono particolarmente sensibili all'esperienza(Levelt and Hubener 2012). Tre giorni di DM nei topi giovani sono, infatti, sufficienti a causare un fenomeno di plasticità chiamato spostamento della OD, che consiste nel cambio delle risposte dei neuroni binoculari i quali cominciano a preferire gli input provenienti dall’occhio non deprivato(Hensch 2005).La plasticità corticale visiva e la plasticità del cervello, in generale, mostrano una diminuzione significativa nell'età adulta: infatti se la deprivazione sensoriale è effettuata in topi adulti, non è possibile osservare cambiamenti significativi nelle risposte neuronali.
L’obiettivo principale del mio progetto di tesi è stato testare gli effetti del digiuno sulla plasticità della corteccia visiva nel topo adulto, e cercare di identificare i meccanismi responsabili della sua azione sulla plasticità. Il progetto ha previsto misurazioni delle risposte fisiologiche in vivo nel SNC e prelievi di tessuti per poter effettuare analisi anatomiche, biochimiche e molecolari (immunofluorescenza su fettina, western plot, qPCR).
Il protocollo sperimentale prevedeva due gruppi: topi adulti (Giorno Post-natale (P) 120) sottoposti a digiuno per 48 ore o nutriti ad libitum (gruppo di controllo). Tramite esperimenti di fisiologia in vivo abbiamo testato le proprietà della corteccia visiva. In particolare, abbiamo effettuato l’imaging ottico del segnale intrinseco, per registrare l’attivazione dell’area corticale visiva primaria in seguito a stimolazione tramite specifici stimoli visivi. In base ai risultati ottenuti, abbiamo poi eseguito delle analisi di biologia molecolare per individuare i meccanismi alla base delle alterazioni delle proprietà dei circuiti neuronali osservate in vivo: analisi dell’espressione genica tramite real-time PCR, immunofluorescenza di specifici marker di plasticità su fettina di corteccia celebrale.
I dati ottenuti dimostrano come il digiuno effettuato simultaneamente alla DM sia capace di promuovere la plasticità di OD nell’animale adulto, il quale normalmente non mostra questa proprietà. Per cercare di spiegare tale fenomeno a livello molecolare, abbiamo confrontato l’espressione di diversi geni attività dipendenti correlati alla plasticità, in corteccia visiva. Da tale analisi abbiamo riscontrato che, in seguito a DM, ci sono differenze significative nell’espressione di tali geni tra la corteccia ipsilaterale e quella contralaterale all’occhio deprivato nel topo tenuto a digiuno, mentre non ci sono differenze significative nelle cortecce di topi nutriti ad libitum.
nella quale abbiamo trovato differenze significative. Inoltre, abbiamo analizzato dei marcatori della plasticità, come neuroni parvalbuminergici (PV) e reti perineuronali (PNNs) su fettine di corteccia visiva di topo.
I risultati ottenuti con questo studio potranno avere impatto non solo sulla ricerca di base, ma anche a livello clinico e in ambito sociale. Infatti, la dieta chetogenica e i supplementi a base di corpi chetonici vengono ampliamente usati dal grande pubblico per migliorare le performance sportive e, recentemente cognitive. Tuttavia, non conosciamo le loro specifiche influenze positive e/o negative a livello del SNC. Il mio studio permette di avere informazioni al riguardo, contribuendo a spiegare alcuni effetti del digiuno sulla plasticità neuronale. Infine, i miei risultati potrebbero incoraggiare un nuovo approccio terapeutico basato sull’utilizzo razionale della nutrizione (specifiche diete, supplementi, digiuno a intermittenza) per il trattamento di diversi disturbi del SNC: dai disordini dello spettro autistico ai disturbi psichiatrici, dall’epilessia ai disturbi di tipo neurodegenerativo.