• Flhf
• interazione
• L2

Bacillus cereus è un bastoncello Gram positivo, sporigeno e mobile grazie alla presenza di flagelli peritrichi. Da lungo tempo noto come capace di provocare tossinfezioni alimentari, B. cereus viene oggi sempre più frequentemente riconosciuto anche come responsabile di altre infezioni locali e di infezioni sistemiche nell’uomo. Il potenziale patogenetico del microrganismo è dovuto alla secrezione di una grande varietà di enzimi e fattori di virulenza, che comprendono emolisine, fosfolipasi, proteasi, citotossine e complessi enterotossici. Tra le emolisine, un ruolo cardine nella patogenesi delle infezioni è svolto dall’emolisina BL (HBL), un’esotossina trimerica costituita da una subunità B, necessaria per il legame ai recettori sulle cellule bersaglio, e da due componenti aventi attività litica, L1 ed L2. L’HBL mostra attività citolitica su diversi tipi cellulari, è in grado di indurre permeabilità vascolare ed ha azione enterotossica.
In uno studio precedente effettuato nel laboratorio in cui è stato svolto il presente lavoro di tesi, è stato dimostrato che la proteina FlhF di B. cereus è necessaria per la corretta produzione di flagelli e per la secrezione di alcuni fattori virulenza, inclusa la componente L2 dell’HBL. Infatti, un ceppo portante una delezione in flhF (flhF) mostrava una significativa riduzione nella quantità di L2 secreta nell’ambiente extracellulare ed una consistente alterazione del numero (da 10-13 a 1-3) e della localizzazione dei flagelli sulla superficie cellulare. Il gene flhF di B. cereus codifica per una proteina citoplasmatica dotata di un dominio C-terminale ad attività GTPasica, denominato NG, estremamente conservato tra le proteine appartenenti alla famiglia delle signal recognition particle (SRP)-GTPasi. Nei batteri, questa famiglia include Ffh e FtsY, proteine necessarie per il trasporto cotraduzionale, dal citoplasma alla membrana plasmatica, di proteine destinate alla secrezione nell’ambiente extracellulare o al collocamento nella membrana stessa. Caratteristica esclusiva della proteina FlhF è, invece, la presenza di un dominio basico N-terminale, denominato dominio B, nativamente unfolded ed a funzione sconosciuta.
Obiettivo principale del presente lavoro di tesi è stato quello di comprendere se FlhF potesse svolgere il ruolo di SRP in B. cereus, mediando il targeting della componente L2 dell’HBL alla membrana plasmatica. La funzione di SRP per FlhF, infatti, non è mai stata dimostrata per alcun microrganismo.
In una prima parte del lavoro, è stato valutato l’effetto della deplezione di FlhF nel ceppo mutante ΔflhF sul livello di espressione del gene codificante L2 (hblC), mediante Real-Time PCR quantitativa. I risultati ottenuti non hanno evidenziato differenze nel livello di trascrizione del gene hblC nel ceppo mutante flhF rispetto al parentale, indicando che la ridotta quantità di L2 extracellulare, osservata nel ceppo mutante, non era da imputare ad una ridotta espressione del gene hblC.
Per valutare se FlhF interagisse fisicamente con la proteina L2, sono stati effettuati esperimenti d’interazione proteina-proteina, in vivo ed in vitro, tra FlhF e L2 mediante le metodiche del Bacterial Two Hybrid System (BACTH) e del pull-down. Per gli esperimenti effettuati utilizzando il sistema BACTH, sono stati allestiti numerosi plasmidi di espressione portanti i geni hblC ed flhF fusi con i frammenti T18 e T25 del gene codificante l’adenilato ciclasi, la cui attività è stata usata come sistema reporter in un ceppo di E. coli difettivo per tale attività enzimatica. Per gli esperimenti di pull-down, è stato allestito un plasmide portante flhF fuso in frame con un tag costituito da sei residui di istidina. La risultante proteina è stata immobilizzata su una resina chelata con cobalto, in grado di legare per affinità il tag di istidine. Sulla colonna è stato applicato un lisato di cellule di E. coli nelle quali era stato fatto esprimere il gene hblC portato da un plasmide. Il ritrovamento di entrambe le proteine nell’eluato della colonna, tramite SDS-PAGE ed immunoblot, indicava interazione proteica. Entrambe le metodiche hanno rilevato l’esistenza di un’interazione fisica tra FlhF e la componente L2 dell’HBL, confermando il potenziale ruolo di FlhF come SRP coinvolta nel trasporto di L2 verso la membrana plasmatica.
Allo scopo di valutare quale porzione della proteina FlhF fosse implicata nell’interazione con L2, la metodica del BACTH è stata applicata ai domini funzionali B ed NG di FlhF. Gli esperimenti di interazione proteina-proteina sono stati, quindi, ripetuti utilizzando vettori che permettessero l’espressione di L2 ed altri, specificatamente allestiti, che permettessero l’espressione dei soli domini B od NG di FlhF. I risultati ottenuti hanno mostrato che entrambi i domini B ed NG di FlhF sono in grado di interagire con L2.
In conclusione, le indagini effettuate nella presente tesi hanno permesso di stabilire che: i) la delezione di flhF non determina alcuna alterazione dell’espressione di hblC; ii) FlhF interagisce fisicamente con L2, sia in vivo che in un sistema in vitro; e iii) entrambi i domini B e NG di FlhF sono coinvolti nell’interazione con L2. Questi risultati suggeriscono, quindi, un ruolo di FlhF come SRP, in grado di legare proteine prodotte nel citoplasma e veicolarle alla membrana plasmatica per la secrezione nell’ambiente extracellulare.

Bacillus cereus is a Gram positive, spore-forming microorganism, motile thanks to peritrichously-distributed flagella. For a long time considered as merely contaminant of aliments, B. cereus is nowadays frequently isolated as etiological agent of extra intestinal local and systemic infections in humans. The ability to secrete a great variety of enzymes and toxins such as hemolysins, phospholipases, proteases, cytotoxins and enterotoxic complexes, supports its pathogenic potential. The trimeric complex hemolysin BL (HBL) is one of the most important virulence factors B. cereus secretes. It is constituted by the B (binding) sub-unit, and the L1 and L2 (lytic) components. HBL possessess cytolitic activity against several cell lines, induces vascular permeability and has enterotoxic activity.
It was previously demonstrated that B. cereus FlhF is required for correct bacterial flagellation and secretion of some virulence factors, L2 component of HBL included. A flhF mutant strain showed a significant reduction of the amount of extracellular L2, as well as, flagella reduction (from 10-13 to 1-3) and mislocalization. flhF gene encodes a cytoplasmic protein harboring a C-terminal domain with GTPase activity (NG domain), which is highly conserved among the group of proteins belonging to the signal recognition particle (SRPs) family. In bacteria, this family includes Ffh and FtsY also, which are essential for co-tradutional transport. These proteins are responsible for the transport of secretory or membrane proteins from the cytoplasm to the plasma membrane. A unique feature of FlhF is the presence of a basic N-terminal domain (B domain) that is natively unfolded ad with unknown function.
The aim of the present study was to better define the role of FlhF as SRP in B. cereus by investigating the interconnections occurring between FlhF and L2, in particular whether FlhF is involved in the targeting of L2 to the membrane. Indeed, no solid demonstration of FlhF acting as an SRP protein has been ever provided.
In the first part of the study, we evaluated the effect of FlhF depletion (in the flhF mutant of B. cereus) on the expression of the L2 encoding gene (hblC) by quantitative Real-Time PCR analyses. No effect on hblC transcription level was evidenced, thus suggesting that the reduced amount of extracellular L2 observed in the mutant strain, was not due to reduced hblC expression.
To evaluate whether FlhF and L2 physically interact, we performed both in vivo and in vitro protein-protein interaction experiments using the Bacterial Two Hybrid System (BACTH) and the pull-down technique, respectively. In order to perform BACTH experiments, we constructed several expression vectors carrying hblC and flhF fused in frame with the adenylate cyclase fragments T18 and T25. Adenylate cyclase activity was used as reporter system in an adenylate cyclase defective E. coli strain co-transformed with combinations of vectors carrying hblC and flhF. For pull-down experiments, we prepared a recombinant vector containing an his-tagged copy of flhF. The resulting protein was immobilized on a cobalt chelate affinity resin, specifically prepared to bind his-tag fused proteins. The resin was incubated with an E. coli cell lysates expressing hblC and therefore containing L2. In case of protein-protein interaction, the two proteins co-elute from the column after several washes aimed at eliminating non-specific binding. The eluate was subjected to SDS-PAGE and immunoblot and the presence of both FlhF and L2 indicated that a physical interaction between these two proteins occurred. Both BACTH system and pull-down experiments demonstrated that FlhF physically interacts with the L2 component of HBL, thus reinforcing the hypothesis that FlhF acts as SRP in the transport of L2 to the bacterial membrane.
To evaluate which of the different FlhF portions is able to interact with L2, we applied the BACTH approach to understand which domain of FlhF is involved in the interaction with L2. Again, we performed protein-protein interaction experiments using vectors constructed properly to express L2 and the single B and NG domain, instead of the whole FlhF protein. The results indicated that both B and NG interact with L2.
In summary, the overall results obtained from this study indicated that: i) flhF deletion does not have effects on hblC expression; ii) FlhF physically interacts with the L2 component of hemolysin BL in vivo and in vitro; and iii) the B and the NG domains of FlhF are both involved in the interaction between the FlhF and L2. These data support the role of FlhF as SRP in B. cereus in the binding of proteins in the cytoplasm and their targeting to the membrane for secretion