logo SBA

ETD

Archivio digitale delle tesi discusse presso l’Università di Pisa

Tesi etd-01212020-163025


Tipo di tesi
Tesi di laurea magistrale
Autore
DI CIANCIA, ALESSIO
URN
etd-01212020-163025
Titolo
Il lievito Saccharomyces cerevisiae come strumento per studiare la proteina umana BRAFV600E
Dipartimento
BIOLOGIA
Corso di studi
BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI
Relatori
relatore Cervelli, Tiziana
Parole chiave
  • BRAFV600E
  • Saccharomyces cerevisiae
Data inizio appello
10/02/2020
Consultabilità
Non consultabile
Data di rilascio
10/02/2090
Riassunto
Riassunto
Il melanoma è un tumore maligno della pelle spesso associato a mutazioni nel gene BRAF. BRAF è un oncogene che codifica una MAPK (mitogen-activated-protein-kinase), chinasi del pathway RAS/RAF/MEK/ERK. Questo pathway è essenziale per regolare la divisione e differenziazione cellulare. La maggior parte dei casi di melanoma associati a mutazione a carico di BRAF presenta la sostituzione dell’aminoacido valina (V) con un glutammato (E) in posizione 600 della proteina, BRAFV600E. BRAFV600E è costitutivamente attivo, infatti funziona senza la necessità di formare un dimero indotto da RAS. Inoltre, è stato recentemente osservato che tutte le cellule tumorali umane esprimono non solo la variante di splicing di BRAF Reference (Ref) ma anche la variante X1 che differisce dalla precedente a livello del 3’ UTR e codifica per una proteina diversa nella regione C-terminale di cui non è nota la differenza funzionale. È stato dimostrato in precedenza nel mio laboratorio di tesi che il lievito rappresenta un buono strumento per studiare BRAFV600E. Infatti, la proteina BRAFV600E espressa in lievito è attiva e complementa l’attività di MAPK chinasi del pathway coinvolto nella risposta allo stress salino, detto high-osmolarity glycerol (HOG) pathway. Al fine di identificare interattori funzionali di BRAFV600E è stato fatto uno screening in lievito utilizzando l’Yeast deletion pool (YDP). Questo è un pool di 4741 cloni di Saccharomyces cerevisiae, ognuno deleto per un gene non essenziale. I diversi cloni possono essere identificati tramite sequenze univoche presenti nel genoma e dette Barcodes. Tramite deep sequencing dell’YDP, esprimente BRAFV600E-ref e X1, sono stati identificati dei possibili interattori. Lo scopo generale della mia tesi è quello di usare il lievito come modello per approfondire le conoscenze su BRAFV600E-ref e X1. Un primo obbiettivo del lavoro di tesi è stato quello di validare gli interattori identificati con lo screening. A tale scopo ho trasformato i plasmidi per l’espressione di BRAFV600E ref e X1 in 12 mutanti ed ho valutato l’effetto dell’espressione di BRAFV600E sulla crescita in diverse condizioni, tra cui in presenza di stress salino, mediante spot assay. Da questa analisi sono stati confermati tre interattori di BRAFV600E: il gene RAS2, SHR5 e ELO1. Per capire il loro ruolo nell’attività di BRAFV600E stiamo effettuando studi di inibizione ed over-espressione per i rispettivi ortologhi umani in cellule di melanoma con la mutazione di BRAFV600E.
Al fine di capire le differenze tra BRAFV600E ref e X1 ho cercato di mettere a punto un sistema chiamato tri-ibrido per valutare l’attività chinasica delle due varianti. Questo sistema è una modifica al classico doppio ibrido, ed è specifico per valutare eventi di fosforilazione. La tecnica messa a punto prevede di utilizzare il sistema LexA con il reporter gene GFP. Questo sistema LexA è stato diviso in activation domain e DNA binding domain, rispettivamente espressi come proteine di fusione con ERK e MEK murini. Il saggio rivelerebbe il segnale della GFP in seguito all’ attivazione trascrizionale indotta dalla fosforilazione di ERK in presenza di BRAFV600E. Ci aspettiamo quindi di avere un segnale di fluorescenza proporzionale all’attività chinasica, al fine di osservare possibili differenze tra le due isoforme reference ed X1 di BRAFV600E.
Inoltre, abbiamo intenzione di caratterizzare se BRAFV600E ref e X1 rispondono allo stesso modo al trattamento con i farmaci. Dato che il lievito non è molto permissivo ai farmaci, lo scopo del mio lavoro è stato quello di costruire un ceppo di S. cerevisiae deleto per due geni, ERG6 e PDR5. I due geni ERG6 e PDR5 codificano rispettivamente per la Delta (24) -sterol C-methyltransferase e per la Plasma membrane ATP-binding cassette (ABC) transporter e la loro delezione è risaputo favorire la suscettibilità alle droghe. Il ceppo di partenza per questo lavoro è il ceppo ptp3∆ptc1∆ deleto per due fosfatasi PTP3 e PTC1. È stato dimostrato nel laboratorio di tesi che l’espressione di BRAFV600E in questo ceppo è tossica a causa dell’iperattivazione dell’HOG pathway. Quindi in presenza di un inibitore di BRAFV600E osserveremo il recupero della crescita. Mediante la tecnica del delitto perfetto, ho costruito il ceppo ptp3∆ptc1∆erg6∆pdr5∆ in cui ho espresso BRAFV600E e sto testando la sensibilità a diversi farmaci.

Abstract
The Melanoma is a malignant skin tumor, often associated with mutation of the BRAF protein. BRAF is an oncogene that coding for a MAPK (mitogen-activated-protein-kinase) involved in the pathway RAS/RAF/MEK/ERK. This pathway is essential for cell division process and for differentiation process. Ma majority of the melanoma skin cancer cases, associated with BRAF mutation, shows the substitution of the amino acid valine (V) with glutamine (E) in position 600 of the BRAFV600E protein. BRAFV600E is constitutively activated and works without the dimerization induced by RAS. Furthermore, has been observed that all the cancer cell lines express not only the splicing variant BRAF reference but also the X1 variant. The X1 variant differs from the Ref. variant at the 3’UTR encoding for a different c-terminal region of the protein. Has been previously demonstrated, in my laboratory, that the yeast represents a good tool for the study of BRAFV600E. In fact, the protein BRAFV600E expressed in yeast is active and complements the MAPK activity in the osmotic stress activated pathway called HOG pathway. To identify functional interactors of the BRAFV600E protein has been made a screening using the Yeast Deletion Pool. This is a pool of 4741 different clones of Saccharomyces cerevisiae, each mutated (deleted) in one non-essential gene. Each clone can be identified through specific DNA sequence called Barcode, unique for each gene deletion. Through the deep sequencing of the YDP, expressing BRAFV600E ref and X1, has been identified two possible functional interactors of the protein. The aim of this work is to use the Yeast as a model for masters the knowledge about BRAFV600E ref and X1. The firs aim is to validate the functional interactor identified through the YDP screening. For this purpose, I have transformed the pYes2 BRAFV600E ref and X1 plasmids in 12 different yeast mutants. Then I have evaluated the effects of the expression of the protein BRAFV600E upon the growth through the spot assay made in different condition, such as saline stress. From this analysis has been confirmed 3 functional interactors of the BRAFV600E protein: RAS2, SHR5 and ELO1. To understand their role in the BRAFV600E activity, we plan to repress and over-express these genes in different melanoma cell line that express BRAFV600E.
To understand the difference between BRAFV600E ref and BRAFV600E X1, we have tried to develop a Tri-hybrid system to evaluate the kinase activities of the two isoforms. This system is a modification of the classic two-hybrid and is specific for characterizing phosphorylation events. The technique exploits the LexA system and the GFP reporter gene. The LexA system has been divided in two parts, activation domain and DNA binding domain, each one expressed as fusion protein, respectively with murine ERK and murine MEK. All the components of the tri-hybrid system are under control of an inducible Galactose promoter. The assay is based on the increased GFP signal induce by the expression ok BRAFV600E. We expect a fluorescent signal proportional to the kinase activity of the two isoforms reference and X1.
Another aim is to understand in BRAFV600E reference and X1 respond to drugs treatment at the same manner. To reach this aim in this work, I tried to build a S. cerevisiae mutant strain, with two gene deletion: ERG6 and PDR5. These two genes codes respectively for Delta (24) -sterol C-methyltransferase and for a plasma membrane ATP-binding cassette (ABC) transporter. These two deletions are known to increase the drugs susceptibility. The initial strain was the ptp3∆ptc1∆, mutated for these two phosphatases: PTP3 and PTC1. Has been demonstrated, previously in my laboratory, that the expression of BRAFV600E in this strain shows toxic effects due to hyper activation of HOG pathway. So, in presence of a BRAF inhibitor we aspect to see a recovery of the growth. The strain ptp3∆ptc1∆erg6∆pdr5∆ was built with the Delitto Perfetto technique, then the strain has been tested for its enhanced sensibility to drugs.
File