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Tesi etd-01212015-150721


Thesis type
Tesi di dottorato di ricerca
Author
POMPONI, ALICE
URN
etd-01212015-150721
Title
Study of an alternative gene embedded in the West Nile virus genome
Settore scientifico disciplinare
MED/07
Corso di studi
FISIOPATOLOGIA CLINICA E SCIENZE DEL FARMACO
Commissione
tutor Azzi, Alberta
Parole chiave
  • N-NS4B/WARF4
  • WARF4
  • WNV
  • Alternative open reading frame
  • West Nile Virus
Data inizio appello
14/02/2015;
Consultabilità
completa
Riassunto analitico
RIASSUNTO<br>L&#39;analisi bioinformatica del genoma del virus West Nile (WNV) ha individuato 6 schemi di<br>lettura alternativi,<br>il più lungo dei quali (444bp), denominato WARF4, è presente<br>solamente nei ceppi di WNV appartenenti alla linea virale I. Il gene alternativo è<br>sovrapposto all’estremità 3&#39; del gene NS4B ed in parte alla regione 5’ del gene dell’NS5.<br>L&#39;utilizzo di WARF4 è stato indirettamente dimostrato mediante l&#39;individuazione di<br>anticorpi specifici in sieri equini positivi al WNV. Poiché la sequenza di WARF4 è integrata<br>nel gene della proteina virale NS4B, la nuova proteina è stata rinominata N-NS4B/WARF4.<br>Lo scopo di questo progetto è dimostrare la produzione di N-NS4B/WARF4 in colture<br>cellulari eucariotiche infettate con il virus West Nile. A tal fine abbiamo prodotto una una<br>proteina ricombinante che include l&#39;intera sequenza dello schema di lettura alternativo.<br>Questa proteina è stata utilizzata come immunogeno per la produzione di un anticorpo<br>monoclonale anti-WARF4, chiamato MAb 3A12. E&#39; stata inoltre prodotta una proteina<br>ricombinante che comprende la sequenza COOH terminale del gene NS4B da utilizzare<br>come controllo nei test di validazione dell&#39; anticorpo.<br>MAb 3A12, è stato dapprima utilizzato in saggi immunoenzimatici che hanno confermato<br>la sua specificità: in particolare è stata individuata la regione della proteina riconosciuta<br>dall’anticorpo osservando la sua reattività in western blot con quattro peptidi sintetici che<br>coprono tutta la sequenza aminoacidica codificata da WARF4.<br>L’anticorpo MAb 3A12 ha riconosciuto la nuova proteina in cellule VERO infettate con il<br>WNV appartenente alla linea virale I sia in esperimenti di immunofluorescenza che in<br>western blot , mentre non ha reagito con cellule infettate con la linea virale II del virus.<br>I risultati di analisi in western blot eseguite su lisato di cellule VERO infettate a tempi<br>diversi dimostrano che N-NS4B/WARF4 viene espressa in quantità maggiore nella tarda<br>fase dell’infezione.<br>L’espressione “in vivo” della proteina N-NS4B/WARF4 è stata dimostrata indirettamente,<br>sebbene su un numero limitato di campioni, valutando la sua immunogenicità in individui<br>infettati con il WNV.<br>Al momento non ci sono informazioni sperimentali circa il meccanismo di traduzione della<br>proteina N-NS4B/WARF4, tuttavia si può supporre che la proteina venga prodotta in<br>seguito ad uno scivolamento del ribosoma in posizione -1 durante la traduzione della<br>poliproteina virale. Questo meccanismo di traduzione è già stato descritto per il West Nile<br>ed è promosso da specifiche sequenze dell’RNA (slippery sequences associate a<br>pseudoknot) rilevate dalle analisi bioinformatiche effettuate sui genomi virali analizzati.<br>Come suggeriscono anche i dati ottenuti in western blot, in seguito allo scivolamento del<br>ribosoma in posizione -1 la proteina codificata da WARF4 verrebbe sintetizzata come<br>variante carbossi-terminale dell’antigene virale NS4B.<br>Il possibile ruolo della proteina N-NS4B/WARF4 nel corso dell’infezione da WNV resta<br>tuttora sconosciuto, tuttavia recenti dati di letteratura sembrerebbero suggerire un ruolo<br>nella regolazione traduzionale del genoma virale.<br>ABSTRACT<br>Bioinformatics analysis performed on West Nile virus (WNV) genome revealed the presence of<br>six alternative open reading frames, one of which, entitled WARF4, is the longest (444 bp) and<br>exclusively restricted to the viral lineage I.<br>The alternative gene is overlapping the COOH-terminal region of the NS4B gene and a small N-terminal portion of the NS5 gene. Since WARF4 is embedded in the NS4B gene, we rename<br>the novel protein N-NS4B/WARF4.<br>We previously reported that N-NS4B/WARF4 is able to elicit antibodies in WNV infected horses;<br>however, there was no direct experimental proof of the existence of this novel protein. The<br>purpose of this study was to demonstrate the in vitro production of WARF4 protein following<br>WNV infection of mammalian cultured cells.<br>For this purpose we produced two recombinant proteins : His- WARF4, that was used as<br>immunogen for the production of a monoclonal antibody (MAb 3A12), and a NS4B carboxy -<br>terminal portion protein as negative control for the evaluation of the antibody specificity.<br>MAb 3A12 specificity to alternative protein was confirmed by its reactivity to only one peptide<br>among four analyzed that cover the full WARF4 amino acids sequence. This antibody detected<br>the novel protein in WNV lineage I-infected, cultured VERO cells while it did not react with WNV<br>lineage II infected cells. In addition, WARF4 protein was expressed in the late phase of WNV<br>lineage I infection.<br>We indirectly demonstrated the “in vivo” production of N-NS4B/WARF4 by showing its<br>immunoreactivity with human sera obtained from WNV infected patients.<br>We have no experimental information on N-NS4B/WARF4 protein translation, but it appears<br>reasonable to assume that a -1 ribosomal frameshifting mechanism produces the novel protein.<br>This translation mechanism has already been described for West Nile.<br>Since the proposed model requires the presence of specific RNA structures such as slippery<br>sequences associated with pseudknot was carried out bioinformatics analysis that revealed<br>these structures within the NS4B coding region.<br>The data obtained in western blot assays suggest that following the ribosomal frameshifting in -<br>1 frame N-NS4B/WARF4 would be synthesized as carboxy-terminal variant of NS4B antigen.<br>The possible role of the protein N-NS4B/WARF4 during WNV infection is still unknown,<br>however recent literature data seem to suggest a possible role in the translational regulation of<br>the viral genome.<br>
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