• GSTO1
• Trichinella spiralis
• Toxoplasma gondii

Le glutatione transferasi (GST) sono una superfamiglia di enzimi detossificanti di fase II che, utilizzando il glutatione come cofattore, contribuiscono alla biotrasformazione di numerosi composti di natura esogena ed endogena, come gli agenti cancerogeni, i farmaci e i prodotti dello stress ossidativo.
La superfamiglia delle GST si suddivide in tre famiglie: mitocondriali, microsomiali e citosoliche.
La famiglia delle GST citosoliche è la più ampia ed è costituita da proteine estremamente poliforme.
Nell'uomo sono state identificate varie classi denominate: α, μ, π, θ, ζ, δ e più recentemente è stata aggiunta una nuova classe denominata omega (GSTO).
Le proteine appartenenti alle GSTO mostrano caratteristiche assai peculiari: sono prive di attività glutatione transferasica, ma sono dotate di numerose altre funzioni di grande importanza nella risposta allo stess cellulare, quali l'attività tioltransferasica, deidroascorbato reduttasica, monometil e dimetilarseniato reduttasica, la modulazione del trasporto del calcio, l'attivazione post-traduzionale dell'interleuchina 1.
Nell'uomo esistono due forme di GSTO: la GSTO1 e la GSTO2, le quali possiedono nel loro sito attivo una cisteina in posizione 32 (cys 32) e all'estremità N-terminale una coda di 19-20 amminoacidi, caratteristiche peculiari di questa classe di GST.
Lo scopo della mia tesi è stato quello di approfondire il ruolo della GSTO1 e dei suoi meccanismi di regolazione nell'infezione da Trichinella spiralis, e poter comparare i risultati ottenuti con quelli di un altro modello d'infezione parassitaria, ovvero quella da Toxoplasma gondii.
Per la prima volta si è valutata l'infezione sperimentale da Trichinella spiralis nel topo. Questo parassita è un nematode agente eziologico della trichinellosi, ossia una zoonosi causata dall'ingestione di carne cruda o poco cotta di animali (quali, suini, cinghiali, cavalli ecc...) infettati dal parassita, le cui larve sono contenute nel tessuto muscolare scheletrico. Tali larve, penetrando nella fibrocellula muscolare scheletrica, provocano alcuni cambiamenti in essa: la cellula, infatti, acquisisce un nuovo fenotipo diventando la cosiddetta nurse cell (NC), una cellula che perde la funzione contrattile (si ha la scomparsa delle miofibrille) ed acquisisce le caratteristiche necessarie alla sopravvivenza e alla crescita del parassita. I meccanismi responsabili dei cambiamenti che portano alla formazione della NC non sono ancora completamente chiariti.
Toxoplasma gondii è un protozoo intracellulare responsabile della toxoplasmosi, una parassitosi ampiamente diffusa nell'uomo, negli animali da allevamento, da compagnia e selvatici, purchè omeotermi.
La toxoplasmosi è acquisita per via orale, salvo rare eccezioni quali la trasmissione transplacentale da madre a figlio, quella a seguito di trapianto d'organo solido o di cellule staminali e infine attraverso trasfusioni ematiche da donatore infetto acutamente a ricevente non immunizzato.
Precedenti studi, hanno dimostrato che i livelli della GSTO1, normalmente bassi nel tessuto muscolare scheletrico, risultavano elevati all'interno della NC.
A seguito di tali osservazioni, sono stati effettuati studi di ibridazione in situ che hanno dimostrato come ci sia un progressivo aumento dei livelli di mRNA della GSTO1 nella NC all'aumentare dei giorni d'infezione (15,28 e 60 giorni).
Partendo da tali risultati abbiamo valutato tramite tecniche immunoistochimiche i livelli di produzione della GSTO1 al progredire dei giorni d'infezione, all'interno della NC; i risultati hanno dimostrato che la GSTO1, all'interno della NC, aumenta rispetto al tessuto circostante già a 15 giorni d'infezione e rimane alta anche a 28 e 60 giorni, confermando quindi, i precedenti risultati ottenuti con l'ibridazione in situ.
Considerando che è stato dimostrato, che una sovraespressione della GSTO1 è correlata ad un aumento di resistenza all'apoptosi attraverso un aumento dei livelli di fosforilazione del fattore AKT, responsabile della sopravvivenza delle cellule, e all'inibizione della via del fattore JNK, generalmente coinvolta nell'induzione dell'apoptosi, abbiamo valutato, sempre tramite immunoistochimica, i livelli di fosforilazione di queste MAP-chinasi, nella NC a 15, 28 e 60 giorni dall'infezione.
I risultati mostrano che i livelli di fosforilazione di AKT, parallelamente a quelli della GSTO1, aumentano al progredire dei giorni di infezione; invece i livelli di fosforilazione di JKN sono alti a 15 giorni per poi diminuire a 28 e 60 giorni dall'infezione.
Per riuscire a comprendere i meccanismi molecolari dei dati ottenuti in vivo, sono stati effettuati esperimenti in vitro, utilizzando antigene escreto/secreto (ES) di T. spiralis, al fine di mimare quello che accade alla cellula muscolare scheletrica quando viene esposta a molecole prodotte dal parassita. Per ottenere ES sono state isolate, dal muscolo di topo precedentemente infettato, le larve muscolari grazie alla digestione artificiale con HCL e pepsina, quindi queste, dopo essere state lavate con un buffer, sono state sospese in un mezzo ed incubate per 18 h a 37°C con 10% CO2. Il sovranatante, ottenuto dalla sedimentazione delle larve, è stato filtrato e concentrato ed utilizzato infine per il dosaggio delle proteine e per trattare le differenti linee cellulari utilizzate: cellule U937, cellule Jurkat ed due cloni delle cellule HeLa, ossia il clone HeLaGSTO1+ che sovra-esprime l'enzima GSTO1 e il clone HeLaCont di controllo che non sovra-esprime l'enzima.
Il trattamento con ES sulle cellule U937, grazie all'analisi con immunoblotting, indica un aumento dei livelli della GSTO1 rispetto ai controlli, ai vari tempi d'incubazione (24, 48 e 72 ore). Anche i livelli di fosforilazione del fattore ERK1/2, ossia una MAP-chinasi coinvolta generalmente nella proliferazione cellulare, aumentano in seguito al trattamento con ES ai vari tempi. AKT, invece, mostra una lieve attivazione a 48 e 72 ore, ma non sembrano esserci differenze tra le cellule trattate ed i controlli.
Per quanto riguarda JNK se i livelli di fosforilazione nel controllo aumentano lievemente, a 72 ore di trattamento l'aumento è invece molto marcato.
Nei due cloni HeLa: HeLaGSTO1+ e HeLaCont, dopo 24 ore di trattamento ES, i livelli di GSTO1 nei trattati sono aumentati rispetto ai relativi controlli.
Per quanto riguarda JNK si può osservare invece che i livelli di fosforilazione sono più alti nelle cellule HeLaCont rispetto alle cellule HeLaGSTO1+ e non variano dopo il trattamento con ES.
Inoltre, tramite saggio di proliferazione cellulare WST-1, abbiamo osservato che il trattamento con ES per 24 ore è risultato capace di stimolare la proliferazione cellulare solo nelle cellule Jurkat ed U937, alla più alta concentrazione di ES impiegata, ossia 50 μg/ml.
Per quanto riguarda lo studio del ruolo della GSTO1 nel modello toxoplasmosi abbiamo infettato le linee cellulari sopracitate con tachizoiti di T. gondii per 24 ore.
I risultati mostrano che anche l'infezione con T. gondii induce un significativo aumento di proliferazione sulle linee cellulari U937 e Jurkat, in linea con quelli osservati nel trattamento con 50 µg/ml di ES, ma non delle cellule HeLa.
I livelli di GSTO1 a 24 e 72 ore dall'infezione, nelle cellule U937, in base ai risultati dell'immunoblotting, mostrano un incremento dei livelli di espressione di GSTO1 rispetto ai controlli.
Tramite immunoflorescenza abbiamo inoltre osservato che, nelle cellule U937 infettate con T. gondii e nel clone HeLaCont, dopo 24 ore d'infezione, l'enzima GSTO1 trasloca nel nucleo. La GSTO1 è un enzima generalmente citosolico (vedi sopra) ma in alcune condizioni può traslocare nel nucleo, è il caso della progressione neoplastica dell'esofago di Barrett e delle cellule sottoposte a shock termico.
I nostri risultati mostrano per la prima volta la traslocazione nucleare dell'enzima in cellule infettate da un protozoo. Il significato biologico di questa traslocazione è al momento sconosciuto, studiarlo nell'infezione con T. gondii sarà oggetto del prosieguo della ricerca.