• 4T1 mouse mammary gland cancer cells
• cellule di tumore mammario murino 4T1
• cellule NMuMG
• EPR
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• inibizione crescita tumorale
• lncRNA
• METTL7A1
• NMuMG cells
• tumor growth inhibition

Nel laboratorio in cui ho svolto la tesi è stato recentemente identificato nel topo un long non coding
RNA (lncRNA) denominato EPR, acronimo di Epithelial Program Regulator. EPR è un lncRNA
intergenico particolarmente espresso nel tessuto epiteliale e piuttosto ben conservato nell’uomo. Il
lncRNA EPR contiene al suo interno una sequenza ORF (open reading frame), che codifica per un
piccolo peptide. Il peptide si localizza a livello delle giunzioni intercellulari. EPR regola l’espressione
genica sia a livello trascrizionale che post-trascrizionale in cellule di ghiandola mammaria ma e’ stato
dimostrato che questa importante funzione e’ indipendente dalla biogenesi del peptide da esso
codificato.
L’overespressione di EPR in cellule immortalizzate di ghiandola mammaria rallenta fortemente la
proliferazione, inibisce la migrazione e previene alcuni aspetti della transizione epiteliomesenchimale (EMT) indotta da TGF-β. Inoltre, l’espressione di EPR in cellule di ghiandola
mammaria trasformate ha un impatto negativo sulla proliferazione e migrazione e compromette lo
sviluppo tumorale in modelli murini di trapianto ortotopico di cellule tumorigeniche nella mammella.
Per comprendere meglio quali meccanismi siano alla base degli effetti oncosoppressori di EPR, è
stata focalizzata l’attenzione sui geni che sono regolati direttamente dal lncRNA. Uno dei target più
promettenti in questo senso è risultato essere il gene che codifica per la proteina METTL7A1
(METTL7A nell’uomo, anche nota come AAM-B).
METTL7A1 è una proteina poco studiata che, strutturalmente, presenta una regione centrale con
caretteristiche compatibili con una funzione S-adenosil-metiltransferasica. E’ stato descritto che
METTL7A si associa al reticolo endoplasmatico e contribuisce alla formazione delle lipid droplets.
Dall’analisi dei dataset di proteomica pubblicamente disponibili (CPTAC) è emerso che l’espressione
di METTL7A è correlata negativamente con la trasformazione neoplastica in diversi tessuti umani:
l’espressione di questa proteina risulta diminuita in alcuni dei tumori umani più comuni, in particolare
nel tumore al seno, al colon, all’ovario e ai polmoni. In linea con questi risultati, confrontando i livelli
di espressione di METTL7A1 nelle cellule epiteliali di ghiandola mammaria immortalizzate NMuMG
e in cellule trasformate, è risultato che METTL7A1 è fortemente downregolata nelle cellule
trasformate rispetto alle NMuMG.
Alla luce di questi aspetti, è stato scelto di approfondire lo studio sulle funzioni di METTL7A1 nelle
cellule NMuMG e nelle cellule murine di tumore della mammella 4T1 che presentano un fenotipo
simile a quello di tumori umani tripli-negativi. In entrambe le linee cellulari è stata overespressa la
proteina METTL7A1 con tag molecolare FLAG allo scopo di studiare gli effetti fenotipici e il
cambiamento nel comportamento di queste linee in funzione della sua overespressione. Per ciascuna
linea è stata prodotta anche una linea mock (transfettata col vettore vuoto) utilizzata come controllo
negativo.
L’overespressione di METTL7A1 nelle cellule NMuMG provoca la riduzione del potenziale
clonogenico e della migrazione rispetto alle cellule mock. Inoltre, come già osservato per EPR, anche
l’espressione di METTL7A1 riduce alcuni aspetti della EMT indotta da TGF-β .
Nelle cellule 4T1 il livello di espressione della proteina METTL7A1 endogena è così basso da poter
essere considerato assente. Abbiamo, quindi espresso Mettl7a1 in queste cellule. Osservando la
localizzazione di METTL7A1 nelle cellule overesprimenti, è risultato che, anche in questo caso, la
proteina si localizza nel citoplasma. Inoltre, abbiamo effettuato un’ulteriore analisi colocalizzando
METTL7A1 insieme a due marcatori specifici per il reticolo endoplasmatico, calnexina ed ER
tracker®, dimostarndo cheMETTL7A1 si associa, in parte, al reticolo endoplasmatico.
Sono state eseguite diverse analisi volte ad osservare i cambiamenti determinati dall’overespressione
di METTL7A1 nelle cellule 4T1 overesprimenti confrontate con le cellule mock. Abbiamo osservato
che l’overespressione di METTL7A1 diminuisce drasticamente la proliferazione, la migrazione e
l’invasività di queste cellule. Inoltre, la colorazione con falloidina ha evidenziato una diversa
distribuzione dei filamenti citoscheletrici di F-actina nelle cellule mock ed overesprimenti
METTL7A1. Mentre nelle cellule mock le fibre di F-actina sono distribuite all’interno della cellula
in spessi fasci paralleli, nelle cellule overesprimenti risultano distribuite principalmente nella zona
corticale della cellula, un pattern simile a quello che si puo’ osservare in cellule epiteliali non
trasformate. Questo cambiamento e’ in accordo con quanto abbiamo osservato riguardo alla riduzione
di migrazione ed invasività delle cellule overesprimenti rispetto alle mock.
In conclusione, i nostri dati indicano che METTL7A1, attivata trascrizionalmente da EPR media, per
lo meno in parte, le funzioni le funzioni del lncRNA che erano state precedente descritte.
Alla luce di questi risultati la proteina METTL7A umana potrebbe essere un promettente
discriminante tra tessuto neoplastico e tessuto sano. In futuro l’analisi dei livelli di espressione di
METTL7A nel tessuto tumorale potrebbe essere utile a delineare una prognosi più dettagliata e
contribuire così a migliorare l’inquadramento terapeutico. Inoltre, il monitoraggio dei suoi livelli di
espressione potrebbe costituire uno strumento utile durante il follow-up dei pazienti durante e dopo
la terapia.