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• metabarcoding
• autenticazione
• frodi
• prodotti ittici multispecie

La tecnica di DNA metabarcoding (MB), che combina il DNA barcoding con le nuove tecnologie di sequenziamento (Next Generation Sequencing Technologies, NGS) rappresenta lo strumento molecolare più adatto per l’autenticazione di specie in matrici alimentari complesse caratterizzate dalla presenza di più specie. Tuttavia, la sua applicazione nei laboratori operanti nel contesto dei controlli ufficiali e/o dell’autocontrollo aziendale è molto ridotta, in gran parte da attribuire alla mancanza di un protocollo analitico standardizzato. Nel periodo 2021-2022, su richiesta di un’azienda operante nel settore ittico, è stato strutturato dal FishLab (DSV) un piano di campionamento con lo scopo di mettere a punto un protocollo di metabarcoding (MB) a supporto dell’autenticazione di prodotti ittici multispecie. Sono stati analizzati 24 campioni da 9 prodotti ittici (burger, macinato) dichiarati come branzino (D. labrax). È stata preliminarmente applicata la tecnica DNA barcoding (regioni COI e 16Sr RNA) e successivamente il metabarcoding (regione 16Sr RNA). Al fine di valutare possibili contaminazioni nei vari step analitici sono stati inclusi campioni di controllo positivo e negativo. I prodotti di PCR destinati al metabarcoding (n=40), compresi i controlli positivi e negativi, sono stati inviati a una ditta esterna per la purificazione e il sequenziamento NGS. L’analisi bioinformatica è stata eseguita con software R con DADA2 (Callahan et al., 2016). Le sequenze sono state assegnate ad una specie mediante analisi blastn in GenBank con assegnazione di specie con valori di identità > 99%. L’analisi DNA barcoding sul gene 16Sr RNA ha evidenziato la presenza di D. labrax in tutti i campioni. Sul gene COI, sono stati amplificati solo 6 campioni, identificati come S. aurata a causa di una scarsa affinità dei primers COI per D. labrax. 22 dei 40 dei campioni analizzati hanno restituito FastQC con reads di buona qualità. Sulla base dei risultati dell’analisi bioinformatica è stata fissata una soglia (1% delle reads) al di sotto della quale la presenza di una specie si potesse attribuire ad una contaminazione. Tutti i campioni sono stati quindi identificati come D. labrax, tranne uno contenente sia D. labrax che Salmo salar (salmone). La standardizzazione del protocollo MB è necessaria per una corretta interpretazione dei risultati e per poter offrire un servizio adeguato e scientificamente valido alle ditte esterne.

The DNA metabarcoding (MB) technique, which combines DNA barcoding with new sequencing technologies (Next Generation Sequencing Technologies, NGS) is the most suitable molecular tool for species authentication in complex food matrices characterized by the presence of multiple species. However, its application in laboratories operating in the context of official controls and/or farm self-control is very low, largely to be attributed to the lack of a standardized analytical protocol. During the period 2021-2022, at the request of a seafood company, a sampling plan was structured by the FishLab (DSV) with the aim of developing an metabarcoding (MB) protocol to support the authentication of multispecies seafood products. Twenty-four samples from 9 fish products (burger, mince) declared as sea bass (D. labrax) were analyzed. DNA barcoding technique (COI and 16Sr RNA regions) was preliminarily applied followed by metabarcoding (16Sr RNA region). In order to assess possible contamination in the various analytical steps, positive and negative control samples were included. PCR products destined for metabarcoding (n=40), including positive and negative controls, were sent to an external company for NGS purification and sequencing. Bioinformatic analysis was performed using R software with DADA2 (Callahan et al., 2016). Sequences were assigned to a species by blastn analysis in GenBank with assignment of species with identity values > 99%. DNA barcoding analysis on the 16Sr RNA gene showed the presence of D. labrax in all samples. On the COI gene, only 6 samples were amplified and identified as S. aurata due to low affinity of COI primers for D. labrax. Twenty-two of the 40 of the samples analyzed returned FastQC with reads of good quality. Based on the results of the bioinformatics analysis, a threshold was set (1% of the reads) below which the presence of a species could be attributed to contamination. All samples were then identified as D. labrax, except one containing both D. labrax and Salmo salar (salmon). Standardization of the MB protocol is necessary for proper interpretation of results and to be able to offer an adequate and scientifically valid service to outside firms.