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Tesi etd-01102019-112017


Thesis type
Tesi di laurea magistrale LM5
Author
FABIANI, SAMUELA
URN
etd-01102019-112017
Title
Ruolo dell'adenosina nel glioblastoma e nel cross-talk tra cellule tumorali e cellule mesenchimali staminali
Struttura
FARMACIA
Corso di studi
CHIMICA E TECNOLOGIA FARMACEUTICHE
Commissione
relatore Prof.ssa Trincavelli, Maria Letizia
correlatore Dott.ssa Pietrobono, Deborah
Parole chiave
  • glioblastoma multiforme
  • adenosina
  • microambiente
  • EMT
  • cellule staminali mesenchimali
Data inizio appello
30/01/2019;
Consultabilità
parziale
Data di rilascio
30/01/2022
Riassunto analitico
Il glioblastoma multiforme (GBM) è uno tra i tumori maligni più diffusi a carico del Sistema Nervoso Centrale (SNC), in particolare della glia, dove si sviluppa.
Le terapie adottate attualmente sono molteplici, prima tra tutte la resezione chirurgica, seguita dal trattamento con agenti alchilanti, tra i quali la Temozolomide (TMZ). Nonostante questo, il tasso di mortalità rimane elevato, infatti la sopravvivenza media è di soli 1-2 anni dalla diagnosi a causa dello sviluppo di farmaco resistenza e per l’insorgenza di recidive. Uno dei problemi legati al fallimento delle terapie è dato dal fatto che, ad oggi, è ignota l’eziologia del tumore. Tra le teorie più accreditate, vi è quella che il GMB si sviluppi da cellule staminali di tipo neurale, le quali subirebbero una trasformazione nella fase di sviluppo. Inoltre è stata individuata una sottopopolazione di cellule tumorali con caratteristiche analoghe alle cellule staminali di tipo neuronale (brain tumor stem cells), le quali alimenterebbero il tumore e risulterebbero refrattarie alle terapie.
Uno dei fattori che sembra influenzare il comportamento delle cellule tumorali è il microambiente tumorale (TME). Questo è costituito sia da una serie di cellule tra cui le cellule immunitarie, vascolari e cellule staminali mesenchimali, che dalla matrice extracellulare, dove si trovano diverse citochine, chemochine, fattori di crescita e altre molecole di segnale. Il principale ruolo del TME è quello di mantenere l’omeostasi tissutale e modulare la risposta immunitaria. Anche il tumore può influenzare il TME, rilasciando segnali extracellulari, promuovendo l'angiogenesi tumorale e la sua proliferazione, inducendo tolleranza immunitaria periferica. Questo cross-talk delle cellule tumorale con l’ambiente circostante aumenta l’aggressività del tumore favorendone l’invasività e fenomeni di metastatizzazione.
Tra le cellule che possono modificare la composizione del microambiente tumorale troviamo le cellule staminali mesenchimali (MSCs). Le MSCs sono cellule caratterizzate dalla capacità di autorinnovamento e dalla possibilità di differenziarsi in vari tipi cellulari. Recentemente, è stato dimostrato come le MSCs siano capaci di rilasciare sostanze solubili, mRNA ed esosomi capaci di influenzare la crescita e le proprietà del GBM, sia direttamente che tramite l’azione su altri tipi cellulari presenti nel TME.
Interessante sembra essere anche il l’azione dell’adenosina, un composto che secondo alcuni studi, riveste un ruolo interessante nell’interazione con alcuni tumori, con un’azione pro-tumorale. La sua azione pro-tumorale, sembra essere legata al ruolo che riveste nel TME, infatti è una delle molecole presenti al suo interno, la cui funzione specifica è quella di modulare la risposta immunitaria anti-cancro. Generata in seguito a stimoli pro-infiammatori, indotti da stati ischemici o di ipossia, in seguito al legame con alcuni suoi recettori, l’adenosina promuove una risposta immunitaria di tipo antinfiammatorio al fine di ridurre le lesioni tissutali. Ogni recettore per l’adenosina sembra avere un ruolo centrale nel controllo della crescita tumorale e nell’invasività. La concentrazione di adenosina nel fluido extracellulare del tessuto del glioma è stato riscontrato in una concentrazione sufficientemente elevata per stimolare tutti e quattro i sottotipi recettoriali. Nel TME di diversi tumori, sono quindi stati riscontrati livelli di adenosina cronicamente alti, in grado di stimolare i recettori, con un’azione complessivamente favorevole alla sopravvivenza tumorale. Questa molecola inoltre, è stata studiata, negli ultimi tempi, per valutare un suo possibile effetto sulla transizione epitelio-mesenchimale (EMT). Questa transizione indica un cambiamento a livello morfologico delle cellule che, da un fenotipo epiteliale, passano a cellule di tipo connettivale embrionale, più comunemente definite mesenchimali. In questo passaggio le cellule tendono a perdere alcune caratteristiche tipiche del fenotipo epiteliale, acquisendo però altre capacità, tra le quali, maggiore motilità e resistenza all’apoptosi e proprio grazie a queste caratteristiche acquisite, si è supposto che la EMT sia strettamente necessaria affinché un tumore dia metastasi.
Lo scopo del presente lavoro di tesi è stato quello di andare a valutare gli effetti dell’adenosina extracellulare su una linea cellulare di GBM (U343-MG) e sul cross talk con le cellule staminali mesenchimali (BM-MSCs).
In particolare, come primo step, sono stati valutati gli effetti dell’adenosina sulla proliferazione cellulare, attraverso il saggio dell’MTS. L’Adenosina solo ad alte concentrazione è stata in grado di promuovere la proliferazione delle cellule tumorali. Il tumore in risposta ad alti livelli di adenosina può modificare l’espressione di geni coinvolti nella produzione, degradazione e trasporto dell’adenosina stessa. Per questo, i livelli trascrizionali di CD73, CD39, ADK, ADA, ENT1 e ENT2 sono stati valutati tramite analisi Real Time RT-PCR. I risultati ottenuti mostrano come il trattamento con alte concentrazioni di adenosina favorisca l’espressione dei trasportatori e gli enzimi degradativi. Tali risultati sono in accordo con la capacità del tumore di diminuire i livelli extracellulari di adenosina per ridurre l’attivazione del sistema immunitario.
Attraverso la tecnica del Western Blot e della Real Time RT-PCR, è stata valutata se l’adenosina potesse modulare la transizione epitelio-mesenchimale (EMT). I risultati hanno mostrato che l’adenosina di per sé non è capace di modificare l’espressione sia di proteine legate ad un fenotipo epiteliale (CDH1) che mesenchimale (α-SMA). Tuttavia l’adenosina è stata capace di modificare l’espressione di alcuni master gene che regolano l’EMT (Slug e Snail). Infine, è stata presa in analisi la migrazione cellulare, attraverso un saggio di Scratch, eseguito su cellule U343-MG trattate con l’Adenosina. Anche in questo caso, sembra che una concentrazione maggiore di adenosina, corrisponda ad una maggiore capacità di migrazione riscontrata nelle cellule. È stato inoltre eseguito uno studio preliminare delle capacità dell’adenosina di agire su cellule di origine staminale mesenchimale (BM-MSCs). Si sono valutati gli effetti della proliferazione eseguendo il saggio dell’MTS, sono stati poi analizzati, i livelli trascrizionali dei geni precedentemente testati su cellule U343-MG ed infine è stata valutata anche la migrazione attraverso il saggio di Scratch. Dai primi risultati ottenuti sembrerebbe che, per quanto riguarda questa tipologia di cellule, l’effetto dell’adenosina sia opposto a quello visto nelle cellule U343-MG.
In conclusione, i risultati, sembrerebbero suggerire un effetto favorevole a migrazione e proliferazione di cellule di glioblastoma (U343-MG) in presenza di adenosina, con probabili effetti di questa anche sull’EMT. Si stanno valutando inoltre gli effetti della molecola anche su cellule di tipo mesenchimale, al fine di individuare nuove terapie antitumorali.
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