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La metamorfosi è un processo fondamentale nello sviluppo degli Anfibi, in cui assistiamo ad una serie di cambiamenti che coincidono con il passaggio alla vita adulta. Tali cambiamenti coinvolgono tutte le strutture dell’organismo, sia interne sia esterne. Nel girino, animale con abitudini di vita da preda, gli occhi sono disposti lateralmente all’encefalo; al contrario, durante la metamorfosi, assistiamo allo spostamento degli occhi in posizione dorso-frontale, locazione che verrà mantenuta nell’adulto e che coincide con un’abitudine di vita da predatore; ciò comporta l’acquisizione di una parziale binocularità dovuta al sovrapporsi dei due campi visivi, rendendo migliore la percezione della profondità. Tale spostamento degli occhi è accompagnato da un accrescimento asimmetrico della zona del margine ciliare (CMZ) che avviene durante la metamorfosi. In questo frangente, si assiste ad una maggiore proliferazione della CMZ ventrale rispetto a quella dorsale con l’effetto di compensare lo spostamento dell’occhio in senso dorso-frontale, in modo da mantenere inalterata la percezione dell’ambiente esterno. La proliferazione della CMZ dorsale è minore in quanto, in questa regione, permane espressa la deiodinasi di tipo III (D3) che è in grado di inattivare l’ormone tiroideo.
L’ormone tiroideo (TH) svolge un ruolo basilare durante la metamorfosi in quanto molti cambiamenti, sia morfologici sia fisiologici, sono dovuti alla sua azione. I recettori dell’ormone tiroideo sono intracellulari e, in seguito al legame con il TH stesso, sono capaci di traslocare all’interno del nucleo operando come fattori di trascrizione su vari geni, sia stimolandone la trascrizione sia inibendola; uno di questi geni è la deiodinasi di tipo III (D3) la cui trascrizione viene potenziata in risposta all’ormone tiroideo.
Durante lo sviluppo antecedente la metamorfosi, tutte le cellule gangliari della retina emettono assoni che entreranno in contatto sinaptico con il talamo controlaterale, incrociandosi sul pavimento del diencefalo a livello del chiasma ottico. Con la metamorfosi, nella regione del chiasma, si accende l’espressione dell’efrina-B2, proteina esposta sulla membrana citoplasmatica delle cellule del chiasma. Un’esigua percentuale di assoni provenienti dalla retina, e più precisamente dalla regione ventro-temporale, espone sulla membrana citoplasmatica il recettore EphB1, in grado di interagire con l’efrina-B2; al riconoscimento tra ligando e recettore seguono una serie di eventi intracellulari che portano alla repulsione dell’assone dal chiasma, indirizzandolo ad entrare in contatto sinaptico con il talamo ipsilaterale.
Un primo scopo della tesi è stato quello di caratterizzare geni della retina la cui espressione fosse sotto il controllo dell’ormone tiroideo; a tal fine, sono stati condotti alcuni trattamenti con l’ormone tiroideo su girini premetamorfici, controllando che la CMZ ventrale proliferasse maggiormente rispetto alla dorsale mediante esperimenti di incorporazione della bromodeossiuridina nelle cellule in proliferazione. Per saggiare la risposta dei diversi geni al TH, abbiamo proceduto tramite l’analisi di geni candidati, utilizzando le tecniche di ibridazione in situ su sezione, per valutare qualitativamente i cambiamenti nell’espressione genica a livello della retina, e di RT-PCR per un’analisi contemporanea su un numero maggiore di geni. Abbiamo osservato che, oltre a quella di D3, anche la trascrizione dei geni Xotch e CycD1, inerenti il ciclo cellulare, è potenziata dall’ormone tiroideo: tale attivazione risulta maggiore nella CMZ ventrale che nella dorsale. Il passo successivo sarà quello di sfruttare la tecnica dei “microarray” per ampliare ulteriormente la nostra analisi.
Un secondo obiettivo è stato quello di individuare i fattori di trascrizione responsabili dell’attivazione dell’espressione dell’efrinaB2 a livello del chiasma al momento della metamorfosi, con la conseguente formazione delle connessioni retinotalamiche ipsilaterali. A questo scopo, abbiamo rivelato quali geni, codificanti per fattori di trascrizione, siano espressi a livello del chiasma al momento della metamorfosi, individuando i geni Xvax2, Xzic2, Xsix3, Xnkx2.1 e Xdll3. Utilizzando la tecnica della lipofezione, cercheremo di far esprimere precocemente questi fattori di trascrizione in modo da valutare se siano in grado di accendere l’espressione dell’efrinaB2 nel chiasma, con la possibile formazione precoce di connessioni retinotalamiche ipsilaterali. Abbiamo infine caratterizzato l’espressione della proteina dell’efrina-B2 a livello del chiasma a stadi metamorfici, mediante il saggio della “alkaline phosphatase-tag staining”.