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RIASSUNTO
Il presente progetto di tesi, effettuato presso il Laboratorio di Antropologia molecolare del Dipartimento di Biologia (RAD e RAR Prof. Sergio Tofanelli) si è proposto di caratterizzare il microbiota salivare umano e le sue possibili variazioni per fattori endogeni ed esogeni, tramite l’utilizzo della piattaforma di sequenziamento di terza generazione della Oxford Nanopore Technologies (ONT - Oxford, UK)
La tecnologia di sequenziamento ONT utilizza una speciale membrana polimerica elettro-resistente caratterizzata dalla presenza di nanopori proteici allocati all’interno di una cella di flusso. La cella è montata su di un dispositivo portatile, il MinION, collegabile attraverso una porta USB 3.0 ad un PC. Quando alla cella di flusso viene applicata una differenza di potenziale si generano dei flussi ionici attraverso i pori-canale della membrana. Ciascun filamento di DNA, una volta risucchiato in parallelo all’interno dei pori-canale provoca deformazioni del segnale elettrico di base, specifiche per ciascuna base nucleica, che vengono rilevate dal sistema e salvate sotto forma di dati grezzi in formato fast5. Successivamente, i tracciati elettrici vengono tradotti in file di sequenza (reads) in formato fastQ attraverso il software GUPPY (base calling). I file fastQ ottenuti vengono quindi elaborati da un secondo pacchetto di software, EPI2ME, che assegna le reads a unità tassonomiche o regioni genomiche attraverso algoritmi appositamente dedicati.
Il DNA utilizzato è stato estratto dalla saliva di volontari informati di origine italiana e africana subsahariana, reclutati nell’ambito di un progetto di ricerca in collaborazione tra l’Università di Pisa, l’Università di Scienze Gastronomiche di Pollenzo, l’Università di Cagliari e l’Università di Bologna volto ad approfondire l’influenza di varianti del gene TRPV1, che codifica per un recettore sensibile alle alte temperature e ai composti piccanti come la capsaicina, sulla composizione corporea e la percezione gustativa.
Il DNA a disposizione è stato sequenziato assemblando pool genici (pDNA) con composizione diversa, per etnia, sesso e sensibilità alla capsaicina. Per gli Africani si è tenuto conto anche delle forme diplotipiche di due regioni del gene TRPV1. Ogni pool di pDNA creato precedentemente, è stato marcato con uno specifico barcode con il kit “Rapid Barcoding Sequencing”, che permette di sequenziare sulla stessa cella di flusso librerie di sequenziamento appartenenti a pool diversi. Il protocollo è stato suddiviso in due fasi: una prima fase di costruzione della libreria genica ed una seconda fase di sequenziamento della libreria dopo suo caricamento sulla cella di flusso. L’algoritmo di EPI2ME utilizzato è stato WIMP (What’s In My Pot), un flusso di lavoro per la assegnazione tassonomica rapida delle reads sulla base di sequenze di riferimento (RefSeq, NCBI) con procedure BLAST modificate.
I risultati hanno mostrato, per ciascun pDNA, gli stessi generi prevalenti, come Prevotella, Haemophilus, Neisseria, Streptococcus, Veillonella e Rothia, in accordo con quanto riscontrato in letteratura. La diversità a coppie tra comunità microbiotiche è risultata differire significativamente per etnia, sesso, diplotipo TRPV1 e sensibilità alla capsaicina a diversi livelli tassonomici.