• CLN1
• SH-SY5Y
• canali del potassio voltaggio-dipendenti
• imaging del calcio

La lipofuscinosi ceroide infantile (CLN1) è una patologia rara che fa parte di un gruppo di malattie chiamate lipofuscinosi ceroidi neuronali, a trasmissione autosomica recessiva, associata a mutazioni del gene PPT1, il cui prodotto, proteina palmitoil tioesterasi 1 (PPT1), è un enzima lisosomiale coinvolto nella rimozione dei residui di palmitato da proteine S-acilate.
Nelle forme tipiche i bambini iniziano a mostrare un deficit cognitivo con regressione dello sviluppo intorno ai 18 mesi.
In genere entro i 2 anni di età sviluppano anche un deficit visivo legato a distrofia della retina, e inoltre presentano attacchi epilettici ed episodi mioclonici.
Sono infine presenti microcefalia e difficoltà motorie.
Si tratta di una patologia grave e i bambini affetti solitamente non sopravvivono all’infanzia.
Sono stati condotti numerosi studi sia su cellule in coltura che su modelli animali per investigare i meccanismi molecolari che sono alla base della patologia e cercare di sviluppare delle possibili strategie terapeutiche.
Purtroppo, però, tutte le strategie terapeutiche attualmente conosciute non sono in grado di curare la malattia, ma ne migliorano i sintomi prolungando la durata della vita.
Trattandosi di una patologia a trasmissione autosomica recessiva, una possibile strategia potrebbe essere quella di trasferire il gene wild type in modo da prevenire la progressione della patologia e il suo esito finale.
Tuttavia, un possibile problema riguarda l’impatto sulla funzione e sulla vitalità delle cellule nervose della sovraespressione del gene wtPPT1.
In questa tesi, siamo partiti dai dati presenti in letteratura sull’analisi trascrittomica delle cellule di neuroblastoma SH-SY5Y differenziate verso lo sviluppo neuronale che evidenziavano una riduzione di espressione di diversi geni codificanti per canali del calcio e del potassio in risposta alla sovraespressione del gene PPT1 in confronto con cellule transfettate con un vettore vuoto (MOCK).
Combinando la tecnica del patch-clamp con l’utilizzo di vari bloccanti/agonisti selettivi dei canali appartenenti alla famiglia ether-a-go-go (eag) dei canali del potassio dipendenti dal voltaggio abbiamo verificato che, in accordo con i dati di trascrittomica, la sovraespressione di PPT1 è associata alla riduzione di correnti attraverso canali potassio dipendenti dal voltaggio, compatibili con quelli della famiglia Kv12.1-3, codificanti rispettivamente dai geni KCNH8, KCNH3 e KCNH4, espressi prevalentemente a livello del sistema nervoso centrale, o nel caso di KCNH4 a livello dei neuroni corticali.
Inoltre, la sovraespressione di wtCLN1 è associata alla riduzione delle correnti del calcio ad alta soglia e rapida inattivazione, un dato compatibile con la riduzione dell’espressione dei geni CACNA2D2 e CACNA2D3, codificanti per le subunità accessorie dei canali del calcio importanti per la veicolazione in membrana delle subunità formanti il poro dei canali del calcio.
Il dato elettrofisiologico è stato inoltre confermato in maniera indipendente tramite misure di imaging del calcio, che confermano come l’espressione delle conduttanze del calcio dipendente dal voltaggio nelle cellule MOCK sia limitata ad un sottoinsieme della popolazione con le caratteristiche morfologiche delle cellule indirizzate verso un fenotipo neuronale.
La sovraespressione di wtCLN1 in quelle celule con caratteristiche neuronali dimostrano di fatto la capacità di generare risposte compatibili con la presenza di canali del calcio dipendenti dal voltaggio.
Questa ricerca mostra che quella che potrebbe una possibile terapia genica mediante la sovraespressione del gene PPT1 nelle cellule SH-SY5Y è comparabile con l’effetto ottenuto dalla mancanza (e quindi dalla mutazione) dello stesso gene, e fornisce l’indicazione che questo possibile trattamento richiede un’attenta valutazione dei livelli di espressione per ottenere un’azione terapeutica efficace e sicura.