• T3
• MitoK-ATP

Molteplici linee di evidenza indicano le disfunzioni mitocondriali quali determinanti critici della morte cellulare durante la fase acuta dell’ischemia cardiaca, nonché della progressiva perdita dei miociti superstiti durante le fasi subacuta e cronica.
Nonostante le promettenti strategie terapeutiche mirate ai mitocondri emerse da studi sperimentali, pochissime hanno completato con successo i trials clinici. Pertanto, il mitocondrio rimane un potenziale bersaglio non sfruttato di nuove terapie. Sebbene il precondizionamento ischemico sia una potente strategia protettiva nel modello animale, l’esordio improvviso della ischemia miocardica nei pazienti mina l'implementazione del precondizionamento in ambito clinico. Infatti, gli approcci più moderni si concentrano sull'applicazione di manovre di post-condizionamento farmacologico per combattere il danno da riperfusione e il rimodellamento cardiaco avverso.
L’apertura del canale mitocondriale MitoK-ATP è un obiettivo comune di numerose strategie protettive contro lo stress ossidativo e la morte cellulare dopo un danno ischemico. Precedenti studi in vitro riportano un ruolo della 3,5,3' triiodotironina (T3), l’ormone tiroideo biologicamente attivo, nell’indurre l’apertura del canale mitocondriale, ma i meccanismi sottostanti non sono ancora noti. D’altro canto, crescenti dati sperimentali indicano il mitocondrio come target principale della cardioprotezione mediata della T3, soprattutto nelle prime fasi della guarigione della lesione ischemica, facendo ipotizzare il coinvolgimento dell’ormone nella modulazione del canale anche in vivo.
La recente identificazione dei costituenti molecolari del MitoK-ATP ha reso possibile approfondire gli studi sulla regolazione del canale da parte della T3. Pertanto, gli obiettivi principali del progetto di tesi erano: 1) analizzare il coinvolgimento del MitoK-ATP nell’effetto cardioprotettivo evocato dalla T3 dopo un danno cardiaco da ischemia e riperfusione (IR); 2) individuare i meccanismi putativi responsabili di tale azione.
A tale scopo, sono stati utilizzati modelli sperimentali di danno cardiaco sia in vivo sia in vitro affiancati da analisi predittive in silico. Nel modello murino di IR, i ratti erano sottoposti a 30 minuti di legatura della coronaria discendente seguiti da riperfusione. Ventiquattro ore dopo la chirurgia, gli animali che mostravano la sindrome da bassa T3 venivano trattati con T3 a dosi fisiologiche (3 μg/chilo die) o con il suo veicolo per 48h. Gli animali venivano sacrificati a 3 o 14 giorni dall’ischemia per valutare gli effetti del trattamento nel breve e medio termine. Come modello in vitro sono state utilizzate colture primarie di cardiomiociti neonatali di ratto sottoposte a stress ossidativo mediante 6h di trattamento con H2O2 o 24h di incubazione in camera per ipossia. Dopo lo stress, le cellule venivano trattate per 48h con T3 a concentrazioni fisiologiche (3nM) o il suo veicolo.
Nel modello di IR, la bassa T3, che permaneva anche a 72h dalla chirurgia, era associata ad una progressiva compromissione della funzione cardiaca e a ridotti livelli di entrambe le subunità del canale (mitoK e mitosur) nell’area a rischio (AAR) del ventricolo sinistro. Al contrario, il ripristino precoce dell’eutiroidismo si accompagnava ad un miglioramento della funzione cardiaca sia a breve che a medio termine e si associava al recupero dell’espressione di mitoK e mitosur. Nei modelli di stress in vitro la T3, somministrata dopo il danno, assicurava il mantenimento di un adeguato rapporto di espressione mitosur/mitoK, caratteristica che, alla luce di recenti evidenze, risulta essere un requisito indispensabile per garantire la piena funzionalità del canale. Inoltre, l’inibizione farmacologica del MitoK-ATP preveniva in gran parte l’effetto protettivo dell’ormone contro la morte cellulare e le disfunzioni mitocondriali indotti dallo stress ossidativo.
Nel complesso questi dati rafforzano l’importanza del MitoK-ATP come target dell’azione protettiva della T3 sia in vivo che in vitro.
Successivamente, l’analisi in silico ha evidenziato la presenza di siti di consenso per il recettore alfa degli ormoni tiroidei (THRα nei promotori di mitoK e mitosur facendo supporre un meccanismo diretto di regolazione trascrizionale da parte del recettore legato all’ormone. In accordo con tale ipotesi, in un modello di ipotiroidismo nel ratto si riscontravano livelli di espressione significativamente ridotti delle due subunità rispetto al gruppo eutiroideo.
Alla luce di questi dati abbiamo supposto che, dopo stress cardiaco, la stimolazione di fattori in grado di limitare la biodisponibilità dell’ormone tiroideo biologicamente attivo abbia un effetto repressivo su mitoK e mitosur. Per tale ragione, abbiamo quantificato l’espressione dell’enzima Dio3, responsabile dell’inattivazione degli ormoni tiroidei, nel modello di IR e nei due modelli in vitro. In tutte le condizioni sperimentali, il trattamento con T3 induceva una significativa repressione di Dio 3 i cui livelli erano inversamente associati a quelli delle subunità del canale.
Da un punto di vista meccanicistico, un’analisi in silico ha indicato il miR-133a, un mio-mirna T3-dipendente, come responsabile putativo della repressione della Dio3 in presenza dell’ormone. Nell’ultima parte della tesi, attraverso studi in vitro di gain e loss of function e saggi di luciferasi, abbiamo dimostrato il coinvolgimento fondamentale del miR-133a sia nell’indurre l’espressione di mitoK e mitosur, sia nella inibizione post trascrizionale di Dio3.
Nel complesso, i dati ottenuti supportano l’ipotesi che la somministrazione di T3 in modelli di IR, porta ad una normalizzazione dei livelli di espressione di mitoK e mitosur, attraverso la regolazione dell’asse miR-133a /Dio3. È plausibile che il mantenimento di adeguati livelli di espressione dei geni che codificano per le due subunità, assicuri al canale la piena funzionalità necessaria per espletare l’azione cardioprotettiva dopo IR.