• Agrobacterium tumefaciens
• alfa galattosidasi
• beta glucocerebrosidasi
• Oryza sativa
• Plant molecular farming

Negli ultimi 20 anni si è assistito alla produzione, sperimentazione e successiva commercializzazione di una serie di proteine enzimatiche curative per un gruppo di patologie lisosomiali (malattia di Gaucher, mucopolisaccaridosi I, II, VI, malattia di Anderson-Fabry, e malattia di Pompe). La tecnologia utilizzata in tutti questi casi è basata sull’utilizzo del DNA ricombinante in cellule eucariotiche umane (linee fibroblastoidi) o murine (Chinese Hamster Ovary) che necessitano di bioreattori meccanici ad elevato volume. Il sistema utilizzato presenta i difetti di una produzione limitata, di elevati costi di investimento e soprattutto di possibile contaminazione e trasmissione all’uomo di agenti infettivi. Negli ultimi anni, è stato dimostrato che le piante transgeniche rappresentano sistemi competitivi per la produzione di proteine farmaceutiche. Riuscire ad esprimere una proteina ricombinante con potenziale terapeutico in pianta potrebbe riflettersi nello sviluppo di un farmaco più accessibile ai pazienti colpiti da tali malattie. Ciò risulta particolarmente importante nel caso del trattamento di patologie rare come le malattie di Gaucher e Anderson-Fabry. Per superare questi problemi e garantire a tutti i pazienti l’accesso ai medicinali, le piante transgeniche sono state proposte come sistema di produzione alternativo, sicuro e con costi più ridotti.
Lo scopo principale del presente lavoro, svolto presso l’azienda Transactiva Srl in collaborazione con l’Università degli studi di Udine, è stato il miglioramento dell’espressione di enzimi umani ricombinanti quali la β-glucocerebrosidasi e l’α-galattosidasi, esplorando il potenziale di bioproduzione delle piante. Il riso (Oryza sativa L. ssp. japonica, var. CR W3) è stato scelto come specie ospite e la cariosside come organo di accumulo delle proteine lisosomiali di interesse. Per raggiungere lo scopo della tesi, il lavoro è stato suddiviso in 4 fasi: i) creazione di versioni sintetiche dei geni umani codificanti gli enzimi di interesse applicando i criteri del Codon Context per avere un’alta espressione in endosperma della cariosside di riso; ii) realizzazione dei vettori di espressione finali per la trasformazione di riso mediante Agrobacterium tumefaciens; iii) studio dell’effetto che differenti elementi di regolazione usati (promotore, 5’ UTR e 3’ UTR) hanno sui livelli di espressione, eseguendo un sistema di analisi sui trasformati basato su saggio immunoenzimatico DAS-ELISA; iv) verifica dell’effettiva produzione di questi enzimi nella cariosside e del loro peso molecolare grazie alla tecnica Western blot.