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Riassunto

Questo lavoro di tesi si inserisce nell’ambito di un Progetto Bandiera del CNR, il Progetto ENCODER (Engineered Nanostructures for Cellular imaging and for intracellular delivery of Optically active Drugs for cardiac hypERtrophy) della call Nanomax che prevede lo sviluppo e la caratterizzazione di nanostrutture complesse per imaging e/o terapia nell’ipertrofia cardiaca.
Creare un sistema utile allo stesso tempo sia per la diagnosi che per la terapia rappresenta lo scopo di questo progetto ed è definito approccio teranostico.
Il progetto ENCODER si propone di realizzare nanoparticelle coniugate con elementi di riconoscimento specifici, in grado di riconoscere e legare molecole espresse sulla superficie di cellule ipertrofiche e di far penetrare nelle cellule bersaglio molecole terapeuticamente attive
La tesi si è sviluppata seguendo due filoni, uno riguardante la scelta e la caratterizzazione di un oligonucleotide diretto verso il marcatore della patologia, l’altro concernente la caratterizzazione di oligonucleotidi complementari tra loro per la messa a punto di un sistema di distacco termo-foto-indotto e il rilascio controllato di molecole farmacologicamente attive.
Sulla base di dati presenti in letteratura, è stato selezionato come marcatore molecolare dell’ipertrofia cardiaca la proteina osteopontina presente nella matrice extracellulare dei tessuti ipertrofici [Frangogiannis, Physiol rev 2012].
Come oligonucleotide deputato al riconoscimento dell’osteopontina è stato quindi scelto un aptamero a RNA che è stato dimostrato legare e bloccare la proteina in cellule di tumore al seno e ridurre anche la progressione metastatica tumorale [Zhiyong Mi et al., Molec. Therapy 2009].
Abbiamo quindi sintetizzato questo aptamero a RNA utilizzando un sintetizzatore di acidi nucleici e successivamente siamo andati a purificarlo tramite passaggi sequenziali di deprotezione, desalting e cromatografia liquida HPLC.
Per valutare le proprietà di legame dell’aptamero verso l’osteopontina, sono stati eseguiti saggi di affinità come il test ELISA/ELONA in cui la capacità dell’aptamero di legare la proteina è stata confrontata con quella dell’anticorpo e la specificità è stata valutata rispetto ad una proteina di controllo.
Mediante Elettroforesi Capillare siamo poi andati ad analizzare la mobilità dell’osteopontina e dell’aptamero, separatamente ed in miscela in capillari rivestiti e riempiti con matrici semisolide.
Per quanto riguarda invece la coppia di oligonucleotidi complementari da utilizzarsi per il carico di molecole attive sulle nanoparticelle e il loro successivo rilascio alle cellule bersaglio, sono state studiate sequenze e modifiche chimiche alle estremità.
Le sequenze sono state scelte sulla base della loro non-complementarietà con sequenze di RNA messaggero umano e della loro energia di legame che determina specificità e temperatura di dissociazione.
Per legare la sequenza denominata probe alla nanoparticella abbiamo inserito una porzione spacer-SH, mentre per introdurre nel target complementare un fluorocromo è stata effettuata una marcatura dell’oligonucleotide con il marcatore Cy3™ Mono Reactive.
Il fluorocromo introdotto sul target può servire per valutare l’effettiva funzionalizzazione delle nanoparticelle e può essere successivamente accompagnato/sostituito con una molecola farmacologicamente attiva.
Per mettere a punto una procedura di attivazione foto-termica delle sequenze a doppio filamento presenti su particolari nanoparticelle in oro (per permettere rilascio del farmaco in terapia, o del fluorocromo nella diagnosi), siamo andati a misurare la temperatura di melting del doppio filamento formato dai due oligonucleotidi complementari.
Per via spettrofotometrica è stato monitorato l’effetto ipercromico della dissociazione delle sequenze, misurando l’assorbimento a 260 nm dell’oligonucleotide, in un tampone che mima la composizione salina dei fluidi biologici, durante una rampa di temperatura che comprende la temperatura di dissociazione prevista per il doppio filamento.
Anche in questo caso è stata valutata la mobilità in Elettroforesi Capillare dei due oligonucleotidi e del doppio filamento formato dall’associazione di essi.
Grazie a queste caratterizzazioni e funzionalizzazioni è possibile la coniugazione delle sequenze in esame con diversi tipi di nanoparticelle, ottenendo nanostrutture complesse di cui sarà valutata la biocompatibilità su cardiomiociti in coltura e la performance come agenti per imaging molecolare su cellule sane e ipertrofiche. La capacità di internalizzazione e l’efficacia diagnostica e terapeutica saranno poi stimate in vivo su modelli di ipertrofia cardiaca in animali da esperimento.