• glutatione-transferasi omega-1
• chemoresistenza tumorale
• gluthatione-transferase omega-1
• tumoral chemoresistance

RIASSUNTO

La resistenza ai farmaci chemioterapici da parte delle cellule tumorali risulta, ad oggi, un campo di ricerca molto vasto e in continua evoluzione, sia nell'ambito della ricerca di base biochimica, molecolare e genetica che in ambito clinico. Tra i fattori coinvolti nella chemioresistenza un posto di rilievo viene occupato dalla superfamiglia delle glutatione-transferasi (GSTs). In generale, le GSTs comprendono enzimi in grado di catalizzare reazioni di coniugazione del glutatione (GSH) con un gran numero di composti endogeni ed esogeni e rappresentano il fulcro delle reazioni di fase II volte alla detossificazione ed eliminazione degli xenobiotici quali farmaci, pesticidi e contaminanti ambientali. Sono note quattro famiglie e numerose sottoclassi di GSTs, ma tra di esse la classe omega (GSTO) si differenzia dalle altre GSTs per le peculiari funzioni catalitiche. L'analisi strutturale delle GSTO ha infatti consentito di dimostrare la presenza di un residuo di cisteina nel loro sito attivo (Cys32), al posto di una tirosina o una serina comunemente riscontrabili nelle altre sottoclassi. È proprio questa Cys32 a consentire alle GSTO di catalizzare sia reazioni tiol-tranferasiche (glutatiolazione/de-glutatiolazione) che di riduzione di substrati come il deidroascorbato, e alcuni derivati dell’arsenico.
Nell'Uomo sono stati identificati due geni (GSTO1 e GSTO2) che codificano per altrettanti tipi di proteine e la cui espressione è ubiquitaria nel caso di GSTO1, mentre è più limitata (es. testicoli, fegato) per GSTO2. Questo aspetto, unito alle maggiori conoscenze strutturali e funzionali dell'enzima derivato dal gene GSTO1 (GSTO1-1), ha fatto si che la maggior parte degli studi negli ultimi anni si sia concentrata su quest'ultimo. La GSTO1-1 è inoltre altamente conservata nelle diverse specie, visto che è stata ritrovata, oltre che nell’Uomo, anche in alcune specie di piante e di insetti.
La GSTO1-1 agisce come omodimero e studi recenti hanno dimostrato che, grazie alla sua attività tioltransferasica, è in grado di modulare lo stato redox e funzionale di fattori implicati in importanti vie di segnale intracellulari, come quelle di NF-kB e di NLRP3, con conseguenze significative sia nell'ambito della risposta flogistica che nel contesto della progressione neoplastica. La GSTO1-1, inoltre, sembra essere in grado di regolare importanti vie di segnale come quelle di ERK, JNK e AKT, direttamente coinvolte nella sopravvivenza e nella proliferazione cellulare.
Studi condotti nei nostri laboratori hanno dimostrato come proprio le funzioni modulatrici di GSTO1-1, piuttosto che quelle detossificanti, sembrano essere alla base della maggior resistenza al chemioterapico cisplatino delle cellule tumorali che la sovraesprimono. Ulteriori studi sono tuttavia necessari per capire se, e quanto, questo possa considerarsi un meccanismo generale di chemioresistenza. Oltre agli aspetti prettamente funzionali, sono oggetto di studio anche polimorfismi legati alle GSTO, la loro distribuzione e il loro potenziale ruolo patologico in contesti neoplastici e infiammatori.
Sulla base di queste premesse, lo scopo di questa Tesi è quello di valutare il possibile ruolo protettivo della GSTO1-1 nei confronti di diversi tipi di farmaci ad azione chemioterapica e di ricercare gli eventuali meccanismi molecolari che vi stanno alla base. Vista la duplice azione enzimatica svolta dalla GSTO1-1, ovvero tioltransferasica e riducente, sono stati scelti composti noti per produrre citotossicità e morte cellulare mediante meccanismi di azione differenti. In accordo con i dati di letteratura, sono quindi stati selezionati Doxorubicina, Pemetrexed, Topotecan e triossido di arsenico e Ifosfamide. I diversi tipi di azione chemioterapica sono stati appositamente scelti per indagare in modo mirato i meccanismi che potrebbero stare alla base della resistenza conferita dalla GSTO1-1.
Come modelli di studio sono state utilizzate due linee cellulari ottenute a partire dalla linea immortalizzata di cancro della cervice uterina HeLa. Una prima linea è stata ottenuta inducendo una sovraespressione dell'enzima mediante transfezione stabile del cDNA della GSTO1-1 nel vettore di espressione pTre. Una seconda linea, invece, è stata ottenuta inducendo il knock-out genetico della GSTO1-1 attraverso il sistema CRISPR-Cas9. Adeguate linee di controllo sono quindi state utilizzate come riferimento.
Al fine di comprendere l’eventuale effetto protettivo della GSTO1-1 nei confronti dei diversi chemioterapici sopracitati, tutte le linee sono state trattate a diverse concentrazioni di ogni farmaco, e ne è stata valutata la citotossicità attraverso il saggio di vitalità Alamar blue. Sono quindi stati valutati i possibili effetti dei vari chemioterapici, sia sulla localizzazione subcellulare che sulla espressione della GSTO1-1. In particolare, sono stati effettuati dei saggi di immunofluorescenza per valutare la posizione, citosolica o nucleare, dell’enzima GSTO1-1. Inoltre, è stato valutato il grado di induzione di espressione della GSTO1-1 attraverso saggi di immuno-blotting.
I risultati mostrano che l’azione protettiva della GSTO1-1 è molto efficace nei confronti del triossido di arsenico e, anche se sulla base di dati ancora preliminari, del Topotecan. I trattamenti con Doxorubicina e con Ifosfamide non evidenziano un significativo ruolo protettivo da parte della GSTO1-1, mentre nel caso del Pemetrexed l’azione protettiva sembra essere piuttosto marginale.

I saggi di immunofluorescenza condotti trattando con triossido di arsenico per 2, 4 e 24 ore, hanno mostrato inoltre la traslocazione nucleare della GSTO1-1 già dopo due ore di trattamento. Questa osservazione, unita al ruolo della GSTO1-1 nei processi di glutationilazione, potrebbe suggerire che la GSTO1-1 possa interagire direttamente con i sistemi implicati nell’espressione genica e nella riparazione del DNA. Nessun effetto, invece, è stato osservato in merito ai livelli di espressione della GSTO1-1. Il meccanismo di risposta al triossido di arsenico è stato infine approfondito nelle linee modificate per l’espressione di GSTO1-1. I dati ottenuti mostrano che il trattamento con triossido di arsenico induce l’attivazione differenziale del fattore pro-apoptotico JNK nella linea silenziata per GSTO1-1, e delle chinasi Akt e ERK1/2, associate a segnali di sopravvivenza e di proliferazione cellulare, nella linea che sovraesprime GSTO1-1
In conclusione, i risultati ottenuti mostrano che la sovraespressione di GSTO1-1 si associa ad una maggiore resistenza nei confronti dei due chemioterapici arsenico triossido e Topotecan attraverso meccanismi che comprendono la traslocazione nucleare di GSTO1-1, l’attivazione di pathways di sopravvivenza cellulare (Akt ed ERK1/2) e l’inibizione di pathways di pro-apoptotici (JNK).
D'altra parte, il fatto che la modulazione di espressione della GSTO1-1 cambi la sensibilità delle cellule HeLa solo nei confronti di alcune delle sostanze testate, suggerisce che il meccanismo di risposta cellulare ad esso associato non sia generale, e che la maggiore o minore espressione di GSTO1-1 potrebbe essere un importante fattore discriminante nella selezione del più adeguato trattamento chemioterapico.


ABSTRACT

Resistance of cancer cells to chemotherapy is the first cause of cancer-associated death and it’s a very active field of research. The glutathione-transferase (GST) superfamily consists of a group of isoenzymes involved in phase II detoxification of endogenous and exogenous compounds including drugs, pesticides, and other environmental pollutants. GSTs are expressed at high levels in several types of cancers and are involved in the development of chemoresistance. Among the cytosolic, soluble forms of GSTs, the Omega class of transferases (GSTO) has recently gained interest thanks to its ability to catalyse reduction, as well as thiol-transferase reactions that are not catalysed by other GSTs. These specific activities are supported by the presence of a cysteine residue (Cys32) in the active site of GST-Omega, replacing a tyrosine or serine residue normally present the other classes of GSTs. GST-Omega can catalyse the reduction of e.g. dehydroascorbate and monomethylarsonic acid (V), but they also modulate the formation/reduction of mixed disulphides between glutathione and protein thiols (glutathionylation/deglutathionylation reactions).
In humans, two GSTO genes have been identified (GSTO1 and GSTO2) encoding for two different enzymatic isoforms, namely GSTO1-1 and GSTO2-2. The expression of GSTO1 is almost ubiquitous, whereas GSTO2 is expressed predominantly in the testis, although moderate levels of expression can be detected in other tissues. To date, a more complete structural and functional characterization was achieved for GSTO1-1 isoform only.
GSTO1 is highly conserved in a wide range of species including bacteria, insects, yeast, mammals, and plants. Different polymorphic variants of GSTO1 were described, possibly varying in their substrate affinity and with significant implications in pathological conditions. GSTO1-1 acts as a homodimer and recent studies showed that, thanks to its thioltransferase activity, it can modulate the redox and functional state of some factors involved in major intracellular pathways, namely NF-κB and NLRP3 signalling, with potential effects in the inflammatory response and in cancer progression. GSTO1-1 play a role also in the modulation of ERK, JNK and AKT pathways, i.e. intracellular pathways involved in cell survival and proliferation. In this perspective, studies performed in our laboratories have demonstrated that cancer cells expressing high levels of GSTO1-1 are more resistant to the chemotherapy drug cisplatin, this possibly resulting from the modulatory functions of GSTO1-1 on pro-survival and anti-apoptotic pathways. Other studies are, however, required to assess whether the latter can be considered a general or a drug-specific mechanism of chemoresistance.
On these bases, the aim of this Thesis was to evaluate the protective role of GSTO1-1 against different types of chemotherapy drugs known to induce cell death through different mechanisms. Doxorubicin, Pemetrexed, Topotecan, arsenic trioxide and Ifosfamide were thus selected based on their known mechanism of action. The human cervical carcinoma HeLa cells were used to obtain two sublines with increased (HGSTO+) or silenced GSTO1-1 (HGSTO-) expression, respectively. The first cell line was obtained by stable transfection of HeLa wild type with a pTre vector containing GSTO1-1 cDNA, whereas the silenced line was produced by using the CRISPR/Cas9-mediated gene knockout system. All the cell lines were incubated with increasing concentrations of the five drugs and the cytotoxicity was evaluated by the Alamar Blue viability assay. The possible effect on the subcellular localization and on the expression of GSTO1-1 was also evaluated by immunofluorescence staining and immunoblotting assays, respectively.
The results obtained show that GSTO1-1 exerts a protective action against arsenic trioxide and, although based on preliminary data, Topotecan. On the other hand, GSTO1-1 overexpression did not produce any significant effect against Doxorubicin- and Ifosfamide-induced cytotoxicity and was only minimally protective against Pemetrexed. Interestingly, immunofluorescence staining revealed the nuclear translocation of GSTO1-1 already after 2 hr of incubation with arsenic trioxide and Topotecan, but no effect was produced on GSTO1-1 expression. Such observations might suggest a possible interaction of GSTO1-1 with factors involved in gene expression and/or DNA repair. Finally, arsenic trioxide treatment also induced a differential activation of MAPKs pathways, depending on GSTO1-1 expression. Indeed, immunoblot analysis showed an increased activation of the pro-survival/pro-growth protein kinases Akt and ERK1/2 in GSTO1-1 overexpressing cells, and the activation of the proapoptotic protein kinase JNK in the GSTO1-1-silenced cell line.
In conclusion, the results obtained for arsenic trioxide and Topotecan seem to confirm what has already been demonstrated for GSTO1-1-dependent cisplatin resistance. GSTO1-1 can directly contribute to neutralization of some chemotherapy drugs by detoxification, but it is also able to modulate the cellular response against part of them through the regulation of pro-survival pathways. The arsenic-induced nuclear translocation of GSTO1-1, moreover, strengthen the connection between this enzyme and the possible functional regulation of genes involved in chemoresistance. On the other hand, Doxorubicin- and Pemetrexed-induced effects suggest that the defense mechanism associated with GSTO1-1 expression might be more specific than tought and that GSTO1-1 expression in cancer might be an important factor in the selection of the most suitable chemotherapy treatment.